$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Выделение и культивирование первичных нетрансформированных стромальных клеток
- Забор и подготовка тканей человека.
- Возьмите образцы сальника человека размером 2см3, удаленные во время операции на брюшной полости, и немедленно погрузите ткань в фосфатно-солевой буфер (PBS) (рис. 1A). Кусочек сальника размером 3 см х 2 см обычно дает 1 миллион первичных мезотелиальных клеток человека (ГПМЦ) и 200 000 первичных фибробластов человека или нормальных фибробластов сальника (NOF).
- Уменьшите PBS, в которую была погружена ткань с 0,5 x g на 3 мин как можно скорее после сбора (< 2 часа в PBS) и перенесите ткань в свежую 20 мл PBS в коническую пробирку объемом 50 мл. Разрежьте ткань на части 5 мм3 путем измельчения скальпелем в стерильной чашке для культуры диаметром 15 см (рисунок 1B).
- Выделение первичных мезотелиальных клеток человека
- Чтобы изолировать ГПМЦ, переложите измельченную ткань в конические пробирки объемом 50 мл и подождите 1 минуту, пока твердые куски всплывут наверх (рис. 1C и D). ГПМЦ и эритроциты (эритроциты) будут присутствовать в жидкости на дне. С помощью пипетки удалите жидкость со дна пробирки в новую коническую трубку. Уменьшите температуру жидкости до 0,5 x g в течение 3 минут и отсасывайте надосадочную жидкость из гранул HPMC/RBC.
- Повторите процесс три раза: добавьте 20 мл PBS в измельченную салфетку, дайте ткани подняться, удалите жидкость со дна пипеткой и в пробирку HPMC/RBC, открутите вниз и удалите надосадочную жидкость. После того, как все спины будут завершены и надосадочная жидкость будет аспирирована, пеллета будет содержать ГПМЦ и эритроциты.
- Поместите все клетки из гранулы в колбу размером75 см 2 в 15 мл полной питательной среды (DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой [FBS], 1% витаминами MEM [93 мг/л], 1% заменимыми аминокислотами MEM [81,4 мг/л], 1% пенициллина стрептомицином [Pen-Strep, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина]).
- Выполните вторичную промывку PBS для изоляции дополнительных HPMC.
- Для вторичной промывки PBS встряхните оставшуюся твердую ткань со скоростью 200 об/мин, 37 °C в течение 10 минут в 20 мл PBS, затем подождите 1 минуту, пока ткань всплывет наверх. Удалите жидкость со дна пробирки в новую пробирку, центрифугируйте при 0,5 x g в течение 3 минут и отаскайте надосадочную жидкость.
- Поместите все ГПМЦ/эритроциты из вторичной PBS в отдельную колбу 75 см2 в 15 мл полной питательной среды.
- Чтобы изолировать остатки ГПМЦ, встряхните измельченную салфетку при 200 об/мин, 37 °C градусов в течение 10 мин в 20 мл раствора трипсина 1:1 0,25% 25 мМ ЭДТА:ПБС по объему. Дайте ткани подняться, соберите жидкость со дна пробирки в новую пробирку объемом 50 мл и отжимайте при 0,5 x g в течение 3 минут.
- Отсадите надосадочную жидкость и поместите все ГПМЦ/эритроциты в отдельную колбу размером 75 см2 в 15 мл полной питательной среды.
- Культивируйте пластинчатые клетки при 37°C и 5%CO2 во влажной среде. Подкармливайте покрытые клетки, добавляя 15 мл полной питательной среды на 3 и 5 день, не удаляя отработанную среду. ГПМЦ можно культивировать в течение 5-7 дней перед разделением.
- Во всех экспериментах используйте ГПМЦ с низким проходом (до пассажа 2), чтобы свести к минимуму дедифференцировку и модификацию исходного фенотипа. Используйте широкоугольный микроскоп предпочтительно с 20-кратным объективом с возможностью пластического дифференциального интерференционного контраста или 4-20-кратным объективом с фазовым контрастом (фазово-контрастные фильтры на микроскопе) для получения всех изображений клеток, и 10-кратным объективом () в светлом поле для анализа иммуногистохимического окрашивания 3,3'-диаминобензидином (DAB).
- Подтвердите, что ГПМЦ имеют кубовидную форму и экспрессируют цитокератин 8 и виментин, выполнив иммуногистохимический анализ (рис. 2A, C, E).
