Моделирование колонизации сальника клетками рака яичников: метод ex vivo для установления колонизации млечными пятнами флуоресцентно меченых раковых клеток яичников в мышиных эксплантах сальника

Аннотация

Источник: Krishnan, V. et al. Подходы in vivo и ex vivo к изучению метастатической колонизации молочных пятен раком яичников в брюшинном жировом покрытии. J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео мы создаем культуру сальникового органа ex vivo, покрытую GFP-экспрессирующими раковыми клетками яичников, чтобы изучить колонизацию рака яичников в экспланте сальника. Этот протокол анализирует структуры иммунных клеток в сальнике, известные как молочные пятна, способствующие метастазам.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Колонизация молочными пятнами ex vivo

1. Установление основных условий культивирования подбородочных органов ex vivo
   1. Поместите каждый сальник во вкладыш с одной культуральной пластиной и поместите в одну лунку 12-луночный тканевый культуральный планшет, содержащий 500 мкл среды DME/F12, содержащей 20% FCS. Поддерживайте культуру органов при температуре 37 °C в среде с 5%_CO2 в течение 24–48 часов и/или более временных точек. Используйте три независимые omenta (тройные выборки) для каждого условия (например, тип носителя/временная точка).
   2. Для подтверждения целостности тканей в экспериментальных конечных точках фиксируют и обрабатывают образцы, как описано в Шаге 1.1.3. Подсчет здоровых и некротических адипоцитов на срезах H&E может оценить целостность тканей. Минимум ~120 клеток из пяти биологических образцов требуется для формирования процента присутствующей живой ткани.
   3. Для измерения функции тканей поместите сальник (n=3) в отдельные лунки 24-луночного планшета, содержащего 500 мкл среды DME/F12 с 20% FCS. Дайте оменте выдержать среду при температуре 37 °C в среде с 5%_CO2 в течение 24 часов, а затем удалите 250 мкл для использования в анализе IL-6 ELISA.
2. Совместное культивирование сальника мыши ex vivo с клетками SKOV3ip.1-GFP
   1. Вырастить и получить флуоресцентно меченные клетки путем пипетирования 1х10⁶ размороженных клеток в 10 мл среды в колбе Т-75. Дайте клеткам расти при 37 °C в среде с 5%_CO2, пока они не достигнут 70% слияния. Трипсинизировать и ресуспендировать в концентрации 2 х 10⁶ клеток на мл.
   2. Нанесите ~6 мкл тканевого клея на мембрану питательного вкладыша и дайте ей высохнуть на воздухе. Дважды промойте мембрану стерильной водой, чтобы удалить излишки клея. Просушите мембраны на воздухе под ламинарным колпаком.
   3. Аккуратно иссеките сальник и приложите его к мембране с клейким покрытием с помощью стерильных щипцов. Дайте ткани прилипнуть к мембране в течение 1 минуты перед добавлением среды. Добавьте 500 мкл клеточной суспензии поверх каждого сальника в каждую культуральную вставку. Заполните область вокруг трансвеллерной камеры 2,5 мл DME/F-12 .
   4. Инкубировать семенник с клеточной суспензией в течение 6 часов при 37 °C в среде с 5%_CO2. Осторожно выньте и промойте оменту ~10 мл PBS. Визуализируйте очаги флуоресцентных раковых клеток с помощью соответствующей системы флуоресцентной визуализации.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Инструменты для препарирования	Инструменты для точной науки	NA
Геймса	Флюка/Сигма Олдрич	48900
5% формалина	сигма	HT501320
DMEM	Корнинг	10-013-СВ
ПБС	Корнинг	21-040-ЧВ	Без кальция и магния
Коллагеназа	Уортингтон	LS004196
Вкладыш для культивальных планшетов Millicell	Многородность	PICM01250
Селл-Так	Корнинг	No 354240 (Английский

)