Получение первичных клеток рака яичников из твердых образцов: метод культивирования эпителиальных клеток рака яичников из образцов опухолей яичников

Аннотация

Источник: Pribyl, L. J. et al. Метод получения первичных клеток рака яичников из твердых образцов. J. vis. Exp. (2014)

В этом видео мы описываем метод выделения и характеристики первичных клеток рака яичников из образцов ткани солидных опухолей яичников. Эпителиальные раковые клетки, полученные с использованием этого протокола, подходят для понимания процессов, которые могут привести к зарождению и развитию рака яичников.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Обработка тканей

1. Работая в стерильных условиях, перенесите образцы в чашку Петри (60 мм x 60 мм), содержащую 10 мл свежего, ледяного PBS, и с помощью стерильного бритвенного лезвия, дополнительно разрезайте на мельчайшие кусочки (2 мм или менее) (рисунки 1A и 1B).
2. Измельченные салфетки переложите в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл предварительно подогретой (37 °C в течение 30 мин) диспазы II (2,4 ед/мл) в DMEM, и инкубируйте при 5%_CO2 и 37 °C в течение 30 мин. Чтобы обеспечить оптимальное разложение образцов, вручную перемешивайте клеточную суспензию каждые 5 минут.
3. После 30-минутной инкубации перенесите (с помощью серологической пипетки объемом 10 мл) клеточную суспензию на сетчатое фильтр (ячейки 70 мкм), расположенное поверх конической пробирки объемом 50 мл, и слегка надавите на сетку с помощью поршня шприца. Отбросьте всю недиссоциированную ткань (оставшуюся на верхней части сетки) и соберите полученную клеточную суспензию в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте при 320 x g в течение 7 мин при 4 °C (Рисунок 2).
4. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл DMEM, содержащего 10% FBS.
5. Инкубируйте клеточную суспензию в чашке Петри при 5%_CO2 и 37 °C (рис. 3).
6. Смените среду через 24 часа после первоначального покрытия. Это позволяет удалить клеточный мусор и большую часть эритроцитов, присутствующих в культуре.
7. Меняйте среду каждые три дня в течение следующих двух недель, после чего культуры первичного EOC готовы к последующему применению.

Результаты

Рисунок 1. Обработка клинических образцов. А) Твердый образец переносят в чашку Петри, содержащую 10 мл свежего, ледяного 1x PBS. Б) Клинические образцы дополнительно разрезаются на части размером около 2 мм

Рисунок 2. О...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1x PBS, стерильный	Инвитроген	14190-144
Завинчивающаяся крышка, образец из полипропилена контейнер, стерильный	Термо Сайентиал
DMEM средний, стерильный	Инвитроген	11995-065 (Английский)
Фетальная бычья сыворотка, стерильная	Гиклон Thermo Scientific	SH30396.03
100х Пенициллин-стрептомицин, жидкий	Инвитроген	15140-122
Dispase II, стерильный	Рош	04942 078 001
Маленькие щипцы с тонким наконечником и скальпель лезвие, стерильное	Научный центр Фишера	щипцы: 08-953E, лезвия: 08-927-5Д
Маленькие ножницы для препарирования, стерильные	Научный центр Фишера	Тел.: 08-945
15 мл Тубы с конической крышкой, стерильные	BD Falcon	352097
50 мл Тубы с конической крышкой, стерильные	BD Falcon	352027
10 мл Серологическая пипетка, стерильная	Корнинг	13-678-11Э
6 мл Поршень шприца, стерильный	Tyco Healthcare	8881516911
Нейлоновый фильтр (70 мкм) ячеистый фильтр, стерильный	BD Falcon	No 352350 (Английский
Чашка Петри 5 см, стерильная	Корнинг	430166
Чашка Петри 10 см, стерильная	Корнинг	430167