1. Формирование сфероидов клеток рака яичников
- Клетки рака яичников, экспрессирующие RFP, культивируют в 10% базовой среде (специальная среда для культивирования клеток, содержащая смесь 199 и MCDB105 в соотношении 50:50, 10% инактивированную фетальную бычью сыворотку и 1% пен-стрептококк). Чтобы экспрессировать RFP в немеченых клетках рака яичников, трансфектируйте клетки плазмидой, содержащей RFP, и выберите клетки, экспрессирующие RFP. В качестве альтернативы вирусные векторы могут быть использованы для временной экспрессии флуоресцентных белков или клетки могут быть предварительно инкубированы красным флуоресцентным клеточным трекерным красителем (Invitrogen).
- Перед формированием сфероидов при раке яичников необходимо приготовить блюда из культур с низким уровнем адгезии 96 лунок с круглым дном. Для получения культуральных планшетов с низкой адгезией добавьте 30 мкл раствора поли-HEMA (6 мг полигидроксиэтилметакрилата в 1 мл 95% EtOH) в каждую лунку 96-луночной чашки для клеточных культур. 96-луночные планшеты инкубируются в неувлажненном инкубаторе при температуре 37 °C для выпаривания этанола, оставляя пленку поли-HEMA на каждой лунке. Эта поли-HEMA пленка предотвращает прикрепление клеток к дну лунки, заставляя клетки расти во взвешенном состоянии. [В качестве альтернативы можно использовать культуральные планшеты со сверхнизким уровнем прикрепления (Corning).]
- Затем трипсинизируйте клетки рака яичников, гранулируйте клетки в настольной центрифуге (Heraeus) при температуре 900 RCF в течение 3 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте в 10% базовой среде.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Отрегулируйте концентрацию клеток таким образом, чтобы на 50 мкл 10% основной среды приходилось 100 клеток.
- Добавьте 50 мкл равномерно взвешенной разбавленной клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночной чашки для культур, покрытых поли-HEMA.
- Инкубируйте 96-луночный планшет в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C в течение 16 часов (это время следует увеличивать или уменьшать в зависимости от количества времени, необходимого конкретной клеточной линии для образования многоклеточных сфероидов, или желаемых экспериментальных условий), чтобы позволить клеткам рака яичников сгруппироваться вместе, образуя один многоклеточный сфероид в каждой лунке. Некоторые опухолевые клетки могут подвергаться апоптозу в этот период, поэтому важно выбрать время до индукции апоптоза.
2. Образование монослоя мезотелиальных клеток
- В колпаке для клеточных культур предварительно покройте лунки 6-луночной чашки MatTek со стеклянным дном фибронектином, добавив 2 мл раствора фибронектина/мл PBS в каждую лунку чашки и инкубируя при комнатной температуре в течение 30 минут. Оптическое качество стеклянных дна в чашках MatTek позволяет получать микроскопические изображения с высоким разрешением.
- Мезотелиальные клетки, экспрессирующие GFP, культивируются в 10% основной среде. Трипсинизируйте пластину мезотелиальных клеток, вращайте в настольной центрифуге (Heraeus) со скоростью 900 об/мин в течение 3 минут, аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте в 10% базовой среде. Используемые здесь мезотелиальные клетки уже экспрессировали GFP на момент их получения, но немеченые мезотелиальные клетки могут быть получены путем трансфекции плазмидой, содержащей кДНК GFP, или предварительной инкубации клеток в зеленом флуоресцентном клеточном трекере (Invitrogen).
- После 30-минутной инкубации фибронектина (на шаге 2.1) промойте лунки чашки MatTek 2 мл PBS.
- Аспирируйте PBS и планшетом 6x10по 5 мезотелиальных клеток на лунку в каждой лунке 6-луночной чашки MatTek. Инкубируйте чашку MatTek в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C в течение ночи, чтобы мезотелиальные клетки прикрепились к чашке и образовали монослой.
3. Анализ клиренса мезотелиальных клеток
- Используйте пипетку для сбора сфероидов рака яичников с 96-луночного планшета с покрытием poly-HEMA.
- Аспирируйте среду из одной лунки 6-луночной чашки MatTek, содержащей монослой мезотелиальных клеток. Умойтесь один раз 2 мл PBS. Добавьте все сфероиды из 96-луночной пластины в одну лунку чашки MatTek (в ~3 раза больше сфероидов, которые будут визуализированы, чтобы учесть попадание сфероидов на ту часть чашки, которая не может быть визуализирована).
- Поместите чашку MatTek на столик инвертированного широкопольного флуоресцентного микроскопа, способного выполнять покадровую съемку в течение не менее 8 часов. Используйте моторизованный столик для отображения нескольких положений в чашке с несколькими событиями интеркаляции сфероидов в одном эксперименте. Мы используем инвертированный моторизованный широкопольный флуоресцентный флуоресцентный микроскоп Nikon Ti-E со встроенной системой идеальной фокусировки и оптикой с малым увеличением [20x-0,75 числовой апертуры (NA)] / дифференциально-интерференционным контрастом (DIC) NA, галогенный трансиллюминатор Nikon с конденсатором большого рабочего расстояния (LWD) 0,52 NA, быстрые (время переключения <100 миллисекунд) фильтры возбуждения и излучения Nikon (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), умные затворы Sutter с быстрым пропускаемым и эпифлуоресцентным световым трактом, моторизованный столик Nikon с линейным кодированием, камера Hamamatsu ORCA-AG с охлаждаемым устройством с зарядовой связью (ПЗС), специально изготовленная инкубационная камера микроскопа с контролем температуры и CO2, программное обеспечение Nikon NIS-Elements AR версии 3 и виброизоляционный стол TMC.
- Сфероиды раковых клеток яичников осядут на дно посуды и прикрепятся к монослою мезотелиальных клеток. Собирайте GFP, RFP и фазовые изображения 20+ взаимодействий сфероидов и монослоев каждые 10 минут в течение 8 часов.
- RFP-экспрессирующие сфероиды раковых клеток яичников будут вторгаться в монослой мезотелиальных клеток, экспрессирующих GFP, создавая дыру в монослое. Через 8 часов измерьте размеры отверстий, обводя черные дыры на изображениях GFP с помощью программного обеспечения Elements (или другого подходящего программного обеспечения, такого как image J). Нормализуйте размер отверстия до начального размера сфероида, разделив размер отверстия через 8 часов на размер сфероида в соответствующем RFP-изображении в нулевой момент времени. В этом примере размер отверстия был измерен только один раз, но его можно измерить несколько раз в течение восьмичасового эксперимента, чтобы лучше понять динамику интеркаляции.
