$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Система применения TTFields in vitro - обслуживание опорной плиты и тарелки
- Промойте посуду и крышки для посуды под проточной водой из-под крана. Затем промойте деионизированной водой и высушите на воздухе лицевой стороной вниз.
- Если в предыдущем эксперименте в блюда было добавлено химиотерапевтическое средство/лекарство, заполните каждую посуду 5% легким раствором моющего средства и оставьте на ночь.
- Тщательно промойте посуду под проточной водой из-под крана, чтобы избежать следов моющего средства внутри посуды. Промойте посуду и крышки деионизированной водой и высушите на воздухе лицевой стороной вниз.
- Положите чистую и сухую посуду с крышками в стерилизационные пакеты. Закройте и поместите пакеты в автоклав посудой вниз. Автоклав в течение 30 мин при температуре не выше 121 °C.
- Установите автоклав на программу сушки, частично откройте дверцу автоклава и просушите посуду в течение 30 минут.
- Протрите опорную плиту тканью, слегка смоченной в 70% этаноле.
2. Настройка эксперимента
ПРИМЕЧАНИЕ: Все оборудование и материалы, используемые в этом протоколе, описаны в Списке материалов. Все описанные ниже шаги должны выполняться внутри ламинарного шкафа при сохранении стерильных условий.
- Приготовьте чистую и стерильную посуду и крышки, как описано в разделе 1. Протрите опорную плиту тканью, слегка смоченной в 70% этаноле.
- Установите посуду TTFields с крышками на опорную плиту, осторожно надавливая на тарелку и поворачивая ее по часовой стрелке примерно на 5 мм, пока край тарелки не зафиксируется на трех штифтах на опорной пластине. Положите на дно каждой посуды стерильный покровный лист толщиной 22 мм (обработанный пластик или стекло).
- Приготовьте клеточную суспензию в полной питательной среде (модифицированная Дульбекко среда Eagle's для U-87 MG и F98; RPMI для A2780 и OVCAR-3; дополнено, как описано в Списке материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации клеток зависят от типа клеток и продолжительности эксперимента; К концу эксперимента не следует превышать 80%-90% роста сливающихся клеток.
ВНИМАНИЕ: Клеточные линии человека могут представлять биологическую опасность, и при обращении с ними следует соблюдать соответствующие меры безопасности.
- Поместите 200 μL клеточной суспензии (обычно 5000-20000 клеток в 200 μL для 72-часового эксперимента, в зависимости от времени удвоения) в виде капли в центр каждого покровного стекла и накройте крышками посуды.
- Инкубируйте при температуре 37 °C в инкубаторе сCO2 до тех пор, пока клетки не слипнутся; на этом этапе возможна ночная инкубация.
- Отсасывайте жидкость из капли с помощью пипетки объемом 200 или 1 000 мкл.
- Аккуратно нанесите 2 мл полной питательной среды, чтобы заполнить каждую посуду. Используйте стерильный наконечник для пипетки и мягко постучите по краям покровного стекла, чтобы выпустить пузырьки воздуха, которые иногда попадают под предметное стекло.
- Накройте посуду крышками и поместите ее в инкубатор сCO2 при температуре 37 °C до начала обработки TTFields.
3. Приложение TTFields
- Перенесите опорные плиты с прикрепленной посудой TTFields в охлаждаемый инкубатор CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Применение TTFields in vitro будет генерировать тепло; Поэтому для компенсации прогрева посуды требуется холодильный инкубатор. Более высокая интенсивность TTFields будет производить больше тепла и потребует более низких температур окружающей среды в инкубаторе (см. Таблицу 1). Клинически значимые интенсивности TTFields достигаются при температуре инкубатора для применения TTFields в диапазоне 18-30 °С.
- Подсоедините гнездовой разъем плоского кабеля к опорной пластине. Включите генератор TTFields.
- Запустите прикладное программное обеспечение TTFields in vitro и выберите настройки эксперимента.
- Определите новый эксперимент. Введите имя эксперимента и владельца эксперимента в пользовательском интерфейсе программного обеспечения на экране компьютера. Отрегулируйте частоту и целевую температуру для каждого блюда или опорной плиты.
- Запустите приложение TTFields с помощью программного обеспечения.
- Убедитесь, что все посуды подключены правильно и что на мониторе отображается светло-голубой цвет. Если тарелка обведена красной рамкой (что означает, что она неправильно подключена), осторожно надавите на нее и медленно вращайте вперед и назад, пока контакты не восстановятся и тарелка не станет светло-голубой.
- Оставьте систему нанесения TTFields in vitro включенной на срок до 24 часов.
- Если эксперимент достиг своей конечной точки, остановите его, нажав кнопку ЗАВЕРШИТЬ ЭКСПЕРИМЕНТ в программном обеспечении, и перейдите к шагу 5. Если нет, нажмите на кнопку ПАУЗА эксперимента.
- Отсоедините разъем плоского кабеля от опорной пластины. Выньте опорную плиту с посудой из инкубатора в ламинарный шкаф.
- Заменяйте среду во всех посудах каждые 24 часа и возвращайте опорную плиту в охлаждаемый инкубатор. Подсоедините опорную плиту к генератору с помощью плоского кабеля. Продолжите эксперимент, нажав на кнопку ПРОДОЛЖИТЬ.
См.
| Температура окружающей среды в инкубаторе | Ожидаемая интенсивность TTFields |
| (°C) | (В/см RMS) |
| 18 | 1.62 |
| 19 | 1.55 |
| 20 | 1.48 |
| 21 | 1.41 |
| 22 | 1.33 |
| 23 | 1.26 |
| 24 | 1.19 |
| 25 | 1.12 |
| 26 | 1.04 |
| 27 | 0.97 |
| 28 | 0,9 |
| 29 | 0,83 |
| 30 | 0,76 |
Таблица 1. Температура окружающей среды в инкубаторе и ожидаемая интенсивность TTFields внутри чашки TTFields.
4. Контрольные образцы
Примечание: Выращивайте контрольные клетки в условиях, аналогичных клеткам, обработанным TTFields, за исключением применения TTFields.
- Пластинчатые контрольные образцы с такой же суспензией и на аналогичной поверхности используются для гальванизации TTFields образцов, обработанных TTFields.
- Поместите контрольные чашки в инкубатор сCO2 при температуре 37 °C.
- Заменяйте среду в чашках каждые 24 часа, чтобы она соответствовала условиям среды, обработанной TTFields.
5. Окончание эксперимента
- После нажатия кнопки «ЗАВЕРШИТЬ ЭКСПЕРИМЕНТ» подождите, пока программа извлечет все записи из системы и сохранит их на компьютере.
- Используйте кнопку REPORTS для просмотра файлов журнала температуры, тока и сопротивления каждой опорной плиты, чтобы убедиться, что все посуды были обработаны в соответствии с планом эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все отчеты и журналы сохраняются на компьютере после окончания эксперимента и могут быть просмотрены в любое время.
- Выключите генератор TTFields.
- Отсоедините плоский кабель от опорной плиты и извлеките его из инкубатора.
- Чтобы снять керамическую тарелку, нажмите и поверните тарелку против часовой стрелки, чтобы разблокировать ее от опорной плиты.
- Отнесите посуду в шкаф с ламинарным потоком и асептически снимите покровные стекла. Переложите их в стерильные чашки Петри, содержащие свежую среду или фосфатно-солевой буфер (PBS) для дальнейшего осмотра и оценки.