$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с эмбрионами куриных яиц, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Подготовка яиц
- Перед получением яиц соберите и уравновесьте инкубатор для яиц до 37,8 °C (100 °F) при влажности 60-70% в соответствии с инструкциями производителя><.
заметка: Чтобы свести к минимуму риск загрязнения, для контроля влажности можно использовать автоклавную воду.
- После получения оплодотворенных куриных яиц Rhode Island Red от сертифицированного поставщика яиц лабораторного класса, протрите поверхность скорлупы сухими бумажными полотенцами. Для удаления прилипшего материала можно использовать слегка смоченное бумажное полотенце. Немедленно высушите.
заметка: Смачивание скорлупы жидкостью при температуре ниже 43,3 °C может привести к попаданию бактерий в яйцо. Если вы решите промыть или продезинфицировать яйца, температура жидкости должна быть в пределах 43,3-48,9 °C. Более высокие температуры могут сварить яйца. Выбор дезинфицирующего средства должен производиться исходя из микроорганизмов, вызывающих беспокойство.
- С помощью карандаша или маркера нанесите дату на яйцо. Это считается 0-м днем разработки.
- Поместите яйца в инкубатор для яиц и инкубируйте не менее 7 дней с вращением, чтобы обеспечить развитие CAM. Можно использовать автоматический ротатор или поворачивать яйца на 180° 2-3 раза в день.
2. Вскрытие яиц
ПРИМЕЧАНИЕ: Вскрытие яиц должно быть сделано, когда CAM полностью разовьется. Обычно это происходит на 7 или 8 день разработки.
- Продезинфицируйте шкаф биобезопасности с помощью 70% этанола. Аналогичным образом продезинфицируйте и поместите в шкаф биобезопасности решетку для яиц, свечник для яиц, маркер, беспроводной вращающийся инструмент с точильным камнем из карбида кремния и круглым отрезным кругом, иглу 18 G, контроллер пипетки с четвертьдюймовой вакуумной трубкой, упаковочную ленту, офисные ножницы, изогнутые ножницы, щипцы Semken (или аналогичные), ватные шарики и повязку из прозрачной пленки размером 6 x 7 см. По возможности используйте стерильные, одноразовые или автоклавные инструменты.
- Выключите вращатель яиц. Поместите примерно 1-3 яйца в шкаф биобезопасности на решетке для яиц. Находясь в темноте, приложите свечник к яичной скорлупе, чтобы определить воздушную камеру. Отметьте расположение воздушной камеры.
заметка: Интенсивность освещения от свечника для яиц имеет решающее значение для визуализации внутренней части яйца. Если воздушная ячейка или сосудистая сеть постоянно плохо видны, попробуйте заменить батарейки свечного свеча .
- Переместите свечник для яиц по скорлупе, чтобы найти крупную сеть кровеносных сосудов. При необходимости поверните яйцо. Идеальной сосудистой сетью будет разветвление в районе середины яйца. С помощью маркера нарисуйте сосудистую сеть, которая будет использоваться для имплантации.
- Включите свет в капоте. С помощью аккумуляторного вращающегося инструмента, оснащенного шлифовальным камнем из карбида кремния, просверлите небольшое отверстие в корпусе непосредственно над центром воздушной камеры. Сверлите до тех пор, пока большая часть скорлупы не будет удалена, но белая внутренняя мембрана не останется нетронутой.
заметка: Сверление над воздушной камерой перед воздействием на сосудистую сеть позволяет определить толщину этой конкретной яичной скорлупы над воздушной камерой, а не над CAM и сосудистой сетью. Если КАМ или сосудистая сеть нарушены, то яйцеклетка непригодна для имплантации.
- Просверлите и откройте еще одно маленькое отверстие, где будет открыто сосудистое окно, как это было сделано для воздушной камеры (шаг 2.4).
- С помощью иглы 18 G аккуратно проколите белую внутреннюю мембрану над воздушной камерой и сосудистой системой. Если не удается проникнуть внутрь скорлупы, то тщательно просверлите еще немного. Убедитесь, что белая внутренняя мембрана (но не CAM) нарушена по всей площади бурения. Удаление куска мембраны не требуется.
заметка: Если на этом этапе нарушается работа CAM или сосудистой сети, выбросьте яйцеклетку. Повреждение очевидно, если из просверленного отверстия вытекает кровь или альбумин .
- Выключите свет на капоте. С помощью свечи для яиц убедитесь, что воздушная ячейка была перенесена с конца яйца на область над сосудистой сетью. При необходимости поместите вакуумную трубку, вставленную в контроллер дозатора, вокруг отверстия над исходной воздушной камерой и осторожно применяйте всасывание короткими порциями, чтобы переместить воздушную камеру.
- С помощью маркера обведите новое местоположение воздушной камеры примерно на 0,5 см внутри границы air-CAM. Прикрепите кусок упаковочной ленты прямо над новой воздушной камерой. При необходимости используйте стандартные офисные ножницы, чтобы обрезать ленту до соответствующего размера><.
заметка: Лента может нарушить поток воздуха через оболочку и не должна быть больше, чем необходимо для полного покрытия воздушной камеры.
- Верните яйца в инкубатор в тепло без вращения новой воздушной камерой вверх. Повторите шаги 2.2-2.9, чтобы открыть оставшиеся яйца.
заметка: Протокол может быть приостановлен здесь. Если вы не уверены в качестве развития КАМ, небольшое количество яиц следует пройти через шаг 2.16 до вскрытия оставшихся яиц.
- Поместите примерно 1-3 яйца с перемещенными воздушными ячейками на решетку для яиц в шкафу биобезопасности.
заметка: Следует соблюдать осторожность, чтобы не занести загрязнение в открытое яйцо. Поэтому всегда открывайте яйца в шкафу биобезопасности и по возможности используйте стерильные инструменты и оборудование.
- С помощью аккумуляторного вращающегося инструмента с круглым отрезным кругом разрежьте небольшую линию над границей воздушной камеры, проведенной на шаге 2.8. Убедитесь, что он находится примерно на 0,5 см внутри фактической границы air-CAM, чтобы не нарушить CAM или сосудистую сеть. Разрежьте оболочку полностью, но будьте осторожны, чтобы не проникнуть достаточно глубоко, чтобы нарушить CAM или сосудистую систему.
- С помощью изогнутых ножниц разрежьте вокруг оставшуюся воздушную камеру, чтобы создать окно в оболочке.
заметка: Если на удаленной скорлупе присутствует кровь или оболочка, то яйцеклетка не пригодна для имплантации. Если большая часть яиц не была аккуратно вскрыта, подумайте о том, чтобы подождать еще как минимум 1 день, чтобы открыть оставшиеся яйца, чтобы обеспечить лучшее образование CAM. Если скорлупа остальных яиц не была пробита, вращение яиц внутри инкубатора следует возобновить.
- Проверьте жизнеспособность эмбриона. Жизнеспособные эмбрионы будут иметь обширную сосудистую сеть, прозрачный альбумин, движение эмбриона или видимое сердцебиение.
- С помощью щипцов Семкена вытяните небольшие кусочки ваты из стерильного ватного тампона. Аккуратно промокните поверхность CAM, чтобы удалить пыль и мусор из корпуса.
заметка: Удаление мусора должно быть выполнено в тот же день, когда будут вскрыты яйца.
- Закройте отверстие скорлупы куском прозрачной пленочной повязки размером 6 х 7 см на четверть.
- Верните яйца в инкубатор. Убедитесь, что яйцо надежно сидит открытым окном вверх, а CAM не касается прозрачной пленочной повязки. Используйте кусок решетки для яиц, край вращателя яиц или другой подходящий предмет для подпирания яиц, которые продолжают катиться.
- Повторите шаги 2.10-2.16, чтобы открыть все оставшиеся яйца.
заметка: Вскрытие яйцеклеток не обязательно должно быть завершено в тот же день, что и имплантация. Ожидание хотя бы 1 дня может помочь удалить яйца, жизнеспособность которых была нарушена вскрытием скорлупы.