Моделирование рака на основе хориоаллантоисной мембраны у курицы: модель in ovo для изучения опухолегенеза и метастазирования раковых клеток

Аннотация

Источник: Sharrow, A. C. et al. Использование модели хориоаллантоисной мембраны курицы in vivo для изучения гинекологических и урологических раковых заболеваний. J. Vis. Exp.(2020)

В этом видео мы описываем имплантацию раковых клеток на хориоаллантоисную мембрану курицы для создания модели in ovo. Модель успешно приживляет клетки рака яичников для изучения прогрессирования гинекологического рака.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовка суспензии раковых клеток к трансплантации (вариант 1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть завершено непосредственно перед имплантацией, которая в идеале должна состояться между 7 и 10 днями. Пожалуйста, ознакомьтесь с примечаниями в начале шага 3 или 4 для получения дополнительной информации о дате имплантации. Этот подход был использован для всех клеточных линий и культуральных расщеплений опухолей рака почки.

1. Разморозьте раствор внеклеточного матрикса на льду.
2. Используя механическое и/или ферментативное расщепление, получить одноклеточную суспензию способом, подходящим для имплантируемого типа клеток.
3. Ресуспендирование общего количества клеток, подлежащих имплантации, в подходящую среду для имплантации. Типичны имплантаты 1-2 x 10^{по 6} клеток на яйцеклетку.
   заметка: Среда, используемая для имплантации клеточных линий, обычно представляет собой полную среду, используемую для культивирования клеток, содержащую FBS или заменитель сыворотки. При имплантации опухолевых распадов обычно используется полная среда, используемая для культивирования клеточных линий одного и того же типа рака. Тем не менее, при необходимости в экспериментальном порядке могут быть внесены коррективы в состав среды. Влияние на развитие и рост опухоли должно быть определено эмпирически.
4. Гранулируйте ячейки с использованием скорости центрифуги и времени, соответствующих используемым элементам. Типичная скорость составляет 250-300 x g, а время - 5-10 минут.
5. Удалите надосадочную жидкость из гранулированных клеток с помощью пипетирования. Механическая суспендия клеток в остаточной среде с помощью щелканья или пипетирования. Выложите на лед для остывания. Измерьте объем ячеек и среды с помощью пипетки соответствующего размера.
6. Рассчитайте объемы имплантации таким образом, чтобы 1-2 x 10⁶ клеток были имплантированы в объеме 20-100 мкл на яйцо с конечной концентрацией белка во внеклеточном матриксе 2,7-4 мг/мл. Добавьте среду, любые желаемые факторы роста или добавки и раствор внеклеточного матрикса в соответствии с этим расчетом. Держите на льду до тех пор, пока не будете готовы к имплантации.
   заметка: Для расчетов на этапах 1.3 и 1.6 следует предусмотреть дополнительный объем имплантата в размере не менее половины яйцеклетки, чтобы обеспечить достаточный объем для всех яйцеклеток в группе. Для имплантации клеточных линий рака яичников (т.е. SKOV3 и ID8) было имплантировано 10⁶ клеток на яйцеклетку. Для имплантации клеточной линии почечно-клеточной карциномы RENCA, культивируемых клеток, полученных из переваренной первичной почечно-клеточной карциномы человека, клеточных линий рака предстательной железы (т.е. CWR, C4-2 и MyC-CaP) и клеточных линий рака мочевого пузыря (т.е. HT-1376 и T24), имплантировали 2 x 10⁶ клеток.

2. Подготовка фрагментов опухоли к имплантации (вариант 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть завершено непосредственно перед имплантацией, которая в идеале должна состояться между 7 и 10 днями. Пожалуйста, ознакомьтесь с примечаниями в начале шага 3 или 4 для получения дополнительной информации о дате имплантации. Первичный рак яичников и мочевого пузыря был имплантирован в виде фрагментов опухоли.

1. Разморозьте раствор внеклеточного матрикса на льду. Разведите до конечной концентрации белка 2,7-4 мг/мл в соответствующей среде, содержащей любые желаемые факторы роста или добавки. Держитесь на льду.
   заметка: При имплантации фрагментов опухоли обычно используется полная среда, используемая для культивирования клеточных линий одного и того же типа рака. Тем не менее, при необходимости корректировка рецептуры среды может быть произведена экспериментально. Влияние на приживление и рост опухоли должно быть определено эмпирически.
2. С помощью скальпеля или ножниц вырежьте кусочки из свежей опухоли. Идеальные размеры варьируются от 2-5 мм с каждой стороны. Держите ткани погруженными в среду до тех пор, пока они не будут готовы к имплантации.

3. Имплантация с помощью антипригарного кольца (вариант 1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть имплантированы, начиная с 7-го дня разработки, если CAM полностью развит. Имплантация может произойти в любое время до вылупления, что дает достаточно времени для развития опухоли и проведения желаемого эксперимента, но обратите внимание, что иммунные клетки эмбриона начинают присутствовать примерно на 10-й день после оплодотворения. Скорость роста опухоли значительно варьируется в зависимости от типа клеток и должна быть определена эмпирически для интересующего типа клеток. Клетки рака яичников и рака предстательной железы были имплантированы методом антипригарного кольца. Обратите внимание, что если антипригарное кольцо недоступно, наконечник пипетки можно обрезать до аналогичного размера и использовать.

1. Используйте 70% этанол для дезинфекции шкафа биобезопасности и всех необходимых инструментов: решетку для яиц, изогнутые щипцы для радужной оболочки, антипригарные кольца (внутренний диаметр 1/4 дюйма), стеклянную палочку для перемешивания, пипетки и наконечники соответствующего объема, повязку из прозрачной пленки 6 x 7 см, офисные ножницы, а также маркер или карандаш. По возможности следует использовать стерильные, одноразовые или автоклавные инструменты.
2. Поместите яйца для имплантации на решетку для яиц в шкафу биобезопасности. Выберите приемлемое количество яиц. Обычно до шести. Не допускайте значительного остывания яиц во время работы с ними.
3. Снимите прозрачную пленочную повязку с корпуса, покатывая края по направлению к открытому окну, чтобы не оттягивать кусочки корпуса. Убедитесь, что яйца жизнеспособны и здоровы. Идеальные яйца должны иметь большой сосуд в центре открытого участка с ответвляющимися от него более мелкими сосудами.
4. С помощью изогнутых щипцов радужной оболочки поместите стерильное антипригарное кольцо на CAM над сосудом, в идеале над точкой ветвления. С помощью стерильного стеклянного стержня для перемешивания слегка зашлифуйте CAM.
5. Пипетируйте клеточную суспензию с шага 1.6 в центр антипригарного кольца. В качестве альтернативы с помощью щипцов можно поместить фрагмент опухоли из шага 2.2 в центр антипригарного кольца и накрыть 20-50 мкл раствора внеклеточного матрикса, полученного на шаге 2.1.
6. Запечатайте отверстие куском прозрачной пленки размером 6 х 7 см на четверть. Пометьте яйцеклетки соответствующим обозначением имплантата.
   заметка: Нумерация яиц в группе облегчает продольные наблюдения.
7. Верните яйцо в инкубатор. Убедитесь, что отверстие скорлупы сидит вертикально и что яйцо надежно закреплено.
   заметка: Яйца можно возвращать в инкубатор для яиц без вращения. В качестве альтернативы высокая постимплантационная жизнеспособность может быть достигнута с помощью клеточного инкубатора при температуре 37-38 °C с деактивированным CO₂ и гигрометром для контроля влажности, которая должна составлять 50%-80%.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
010 Тефлон (ПТФЭ) Белый 55 Duro Shore D Уплотнительные кольца	Магазин уплотнительных колец	ТЭФ010	Антипригарное кольцо для посева клеток. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Политетрафторэтилен (ПТФЭ).
Деликатные ножницы для работы; Изогнутый; Шарп-Шарп; длина лезвия 30 мм; 4-3/4 дюйма. Общая длина	Робоз Хирургический	РС6703	Это приведено в качестве примера. Любые подобные изогнутые ножницы также подойдут.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Набор инструментов	Dremel	8050-Н/18	Этот набор содержит все необходимые инструменты
Оплодотворенные куриные яйца (Род-Айленд Ред - Браун, Лабораторный сорт)	АА Лаб Эггс Инк.	Н/Д	Необходимо будет определить местного поставщика яиц, так как этот поставщик осуществляет поставки только на региональном уровне.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Инкубатор для яиц Комбинированный набор	Инкубаторный склад	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Можно использовать и другие инкубаторы для яиц, но их надежность необходимо проверить. После имплантации также можно использовать клеточный инкубатор с отключенным CO2.
Incu-Bright Cool Light Свеч для яиц	Инкубаторный склад	1102	Можно использовать и другие свечи, однако этот предпочтительнее среди тех, которые мы тестировали. Этот свечник входит в вышеупомянутый набор инкубатора.
Матригель Мембранная Матрица HC; Без LDEV	Корнинг	354248	Решение для внеклеточного матрикса
СКОВ3	АТКС	ХТБ-77	Клеточная линия рака яичников человека.
Мешалки с резиновым полицейским; диаметр 5 мм, длина 6 дюймов	Объединенные научные поставки	ГРПЛ06	Это приведено в качестве примера. Любые подобные стеклянные стержни для перемешивания также подойдут.
Щипцы для образцов	Науки электронной микроскопии	72914	Это приведено в качестве примера. Щипцы, используемые для оттягивания оболочки для биолюминесцентной визуализации, имеют длину около 12,8 см с наконечниками шириной 3 мм.

г.