Агарозный спин-даун-анализ: метод встраивания органоидов для гистологического анализа

Аннотация

Источник: Lee, S. et al. Создание и анализ трехмерных (3D) органоидов, полученных из образцов метастазов рака предстательной железы пациента и их ксенотрансплантатов. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео мы проводим спин-понижающий анализ для встраивания 3D-органоидов рака предстательной железы в агарозу. Эти встроенные органоиды могут быть использованы для дальнейшего гистопатологического анализа для изучения роста и развития рака.

Протокол

1. Процессинг органоидов для гистологии: метод Agarose Spin Down

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из предыдущей публикации Vlachogiannis et al. Мы добавили этап, включающий встраивание агарозы, для успешного встраивания всех популяций органоидов.

1. Удалите имеющиеся среды из колодца. Будьте осторожны, чтобы не аспирировать купола цокольной мембраны.
2. Добавьте равный (равный объему среды, удаленной на этапе 1) объем раствора для восстановления клеток и инкубируйте в течение 60 мин при 4 °C.
3. Сместите купол базальной мембраны с помощью пипетки и раздавите купол базальной мембраны с помощью наконечника пипетки. Соберите диссоциированный купол и раствор для восстановления клеток в пробирку объемом 1,5 мл.
4. Центрифугируйте при 300 x g и 4 °C в течение 5 минут.
5. Удалите надосадочную жидкость (раствор для восстановления клеток). Сохраните все надосадочные жидкости в отдельных пробирках до конца, когда наличие органоидов подтвердится на заключительном этапе гранулирования.
6. Добавьте желаемый объем (Таблица 1) холодного PBS и аккуратно пипетируйте вверх и вниз, чтобы механически потревожить гранулу.
7. Центрифугируйте при 300 x g и 4 °C в течение 5 минут.
8. Удалите надосадочную жидкость (PBS).
9. Зафиксируйте гранулу в согласованном объеме (например, 500 мкл для одной гранулы из 24-луночного планшетного условия культивирования, табл. 1) 4% PFA в течение 60 мин при комнатной температуре.
10. После фиксации центрифугируйте при 300 x g и 4 °C в течение 5 минут.
11. Удалите надосадочную жидкость (PFA).
12. Промыть соответствующим объемом (например, 500 μL для одной гранулы из 24-луночного планшетного условия культивирования, Таблица 1) PBS и центрифугировать при 300 x g и 4 °C в течение 5 минут.
13. Приготовьте теплую агарозу (2% агарозы в PBS).<бр /> заметка: В этом случае гранулы ячеек для замороженных секций могут быть непосредственно ресуспендированы в 200 μл компаунда OCT.
14. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл агарозы (2% в PBS).
    1. Сразу после добавления агарозы аккуратно отсоедините клеточную гранулу от стенки пробирки объемом 1,5 мл с помощью иглы 25 G, прикрепленной к шприцу объемом 1 мл. Как показано на рисунке 1, если клеточная таблетка физически не отделена от стенки пробирки объемом 1,5 мл, то существует риск потери всей или части клеточной таблетки в процессе встраивания агарозы.
15. Дождитесь, пока 2% агароза в PBS полностью застынет.
16. Отсоедините затвердевший агарозный блок от пробирки объемом 1,5 мл с помощью иглы 25 G, прикрепленной к шприцу объемом 1 мл.
17. Перенесите отделенный агарозный блок, содержащий клеточную гранулу, в новую пробирку объемом 1,5 мл.
18. Заполните пробирку 70% EtOH и продолжайте использовать обычный протокол обезвоживания тканей и введения парафина.

Таблица 1: Плотность посева, объем базальной мембраны и объем среды, необходимый для одного купола

Культуральная пластина	Плотность затравки (ячейки)	Объем базальной мембраны (μл)	Среда (μл)
48 скважина	25 000-50 000	20	250
24 лунка	50 000-250 000	40	500
6 лунок	50 000-250 000	40	2 000

Результаты

Рисунок 1: Ключевой шаг для успешного встраивания агарозы. Процесс отделения клеточной таблетки от стенки пробирки объемом 1,5 мл.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1 мл Пипеттмана	Гилсон	F123602
1 мл шприца	Шприц BD	329654
Тюбик 1,5 мл	Продукты Spectrum Lab	941-11326-АТП083
Игла 25G	Игла BD PrecisionGlide	305122
4% параформальдегид (PFA)	Альфа Аэсар	Дж61899
70% этанол (EtOH)	ВВР	BDH1164-4LP
агароза	Лонза	50000
Планшет для клеточных культур - 24 лунки	Костар	No 3524
Планшет для клеточных культур - 48 лунок	Костар	No 3548
Планшет для клеточных культур - 6 лунок	Костар	No 3516
Решение для диссоциации клеток, Accumax	Innovative Cell Technologies, Inc.	АМ105
Решение для восстановления клеток	Корнинг	354253
Скребок для ячеек	Сарштедт	83,18
dPBS	Corning/Cellgro	21-031-ЧВ
Наконечники для пипеток объемом 1 мл (синие наконечники)	Fisherbrand Redi-Tip	21-197-85
Маленькая настольная центрифуга	ThermoFisher Scientific	75002426
Компаунд ОКТ	Ткань-Тек	4583
Водяная баня	Фишер Ск	2320

Сталь г.