1. Осаждение отсортированных клеток эпителия предстательной железы в первичную культуру органоидов мыши — ВРЕМЯ: 2-3 ч (за исключением подготовки пластин с поли-HEMA-покрытием)
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины покрыты Poly-HEMA для предотвращения образования 2D-колонии на поверхности лунки под матричным гелем. Приготовьте планшеты с покрытием Poly-HEMA за 1 день до осаждения отсортированных клеток базального или люминального эпителия предстательной железы в культуру органоидов мыши. Разморозьте 1 мл аликвот матричного геля с пониженным фактором роста, далее именуемого матричным гелем, на льду за 2 ч до выполнения шага 1.1. Y-27632 (ингибитор ROCK) следует добавлять в органоидные среды мышей непосредственно перед этапом 1.1. Выполните на льду шаги 1.1-1.8.
- Гранулируйте клетки в пробирках с круглым дном объемом 5 мл центрифугированием при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C и аспирируйте надосадочную жидкость.
- Промойте клеточную гранулу в 500 мкл мышиной органоидной среды (табл. 1).
- Гранулируйте клетки центрифугированием при 800 x g в течение 5 минут при 4 °C и отсасывайте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируется в органоидных средах мыши при плотности клеток 1000 клеток/мкл.
- Для приготовления мастер-смесей смешайте эпителиальные клетки, взвешенные в органоидной среде мыши, с матричным гелем для получения окончательной смеси, содержащей 25% клеток/среды и 75% матриксного геля. Базальные клетки обычно имеют концентрацию 100-2000 клеток/80 μл, тогда как люминальные клетки обычно имеют концентрацию 2000-10000 клеток/80 μл. Плотность покрытых ячеек варьируется в зависимости от предполагаемого дня сбора материала и желаемого последующего применения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Охладите пробирку соответствующего размера для ожидаемого объема мастер-микса за 5 минут до подготовки мастер-микса. Чтобы матричный гель не затвердел во время работы, крайне важно охладить наконечник пипетки, пипетируя матричный гель 3-4 раза перед переносом его в новую пробирку.
- Добавьте 80 мкл матричной смеси геля и клеток на лунку 24-луночного планшета. Рекомендуется пипетировать каплю на нижнюю половину стенки лунки, избегая при этом прямого контакта с покрытием Poly-HEMA. После добавления матричного геля поверните пластину, чтобы смесь матричного геля и клеток образовала кольцо вокруг края лунки.
- Поместите 24-луночный планшет в инкубатор с температурой 37 °C 5% CO2 правой стороной вверх на 10 минут, чтобы матричный гель частично затвердел.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начните нагревать органоидную среду мыши при 37 °C сразу после помещения 24-луночного планшета в инкубатор.
- После инкубации в течение 10 минут переверните 24-луночный планшет вверх дном и инкубируйте еще 50 минут, чтобы матричный гель полностью затвердел.
- Добавьте 350 мкл предварительно подогретой органоидной среды мыши по каплям в центр каждой лунки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сохранения целостности матричного геля крайне важно избегать матричного гелевого кольца при добавлении среды.
- После добавления среды верните 24-луночный планшет в инкубатор с 5%CO2 при температуре 37 °C.
2. Пополнение органоидных сред мыши — ВРЕМЯ: 10-15 мин на 24-луночный планшет
ПРИМЕЧАНИЕ: Существующие среды следует заменять на свежие каждые 48 часов. Перед каждой сменой среды предварительно прогревайте органоидные среды мыши. Не стоит добавлять ингибитор ROCK в среды, используемые для восполнения.
- Наклоните 24-луночный планшет под углом 45° и аккуратно удалите существующую среду из центра каждой лунки с помощью пипетки P1000, избегая матричного гелевого кольца.
- Добавьте 350 мкл предварительно подогретой органоидной среды мыши, как показано в шаге 1.9. Рекомендуется добавлять больший объем среды (до 1 мл) к органоидам, культивируемым дольше 5 дней, чтобы предотвратить быстрое истощение ключевых питательных веществ и факторов роста.
Таблица 1: Инструкция по приготовлению мышиной органоидной среды
|
компонент
| концентрация
|
| В-27 | 1х (разбавить из 50х концентрата) |
| ГлутаМАКС | 1х (разбавить из 100х концентрата) |
| N-ацетил-L-цистеин | 1,25 мМ |
| Нормоцин | 50 мкг/мл |
| Рекомбинантный человеческий EGF, не содержащий животных | 50 нг/мл |
| Рекомбинантный человеческий ноггин | 100 нг/мл |
| R-спондин 1-кондиционированная среда | 10% кондиционированная среда |
| А83-01 | 200 нМ |
| ДГТ | 1 нМ |
| Y-27632 дигидрохлорид (ингибитор ROCK) | 10 μМ |
| Усовершенствованный DMEM/F-12 | Базовые носители |
| R-спондин 1-кондиционированная среда генерируется, как описано в Drost et al. После добавления всех компонентов, фильтр стерилизует мышиную органоидную среду с помощью фильтра 0,22 мкм. Ингибитор ROCK добавляется только во время создания культуры и прохождения органоидов. |
