Экстракция лизата белка: метод лизиса органоидов для сбора клеточных белков

Аннотация

Источник: Crowell, P. D. et al. Оценка дифференцировочной способности эпителиальных клеток предстательной железы мыши с использованием органоидной культуры. J. vis. Exp. (2019)

В этом видео мы демонстрируем экстракцию белковых лизатов из органоидов предстательной железы, культивируемых в матричном кольце базальной мембраны. Анализ экстрагированных белковых фракций может помочь в изучении экспрессии маркеров линии в органоидах.

Протокол

1. Извлечение белка лизата из органоидов предстательной железы для вестерн-блоттинга — ВРЕМЯ: 2,5-4 ч

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед сбором органоидов для экстракции белкового лизата, подготовьте и предварительно подогрейте среды, содержащие рассеивание (Таблица 1).

1. Удалите среду из каждой лунки, наклонив 24-луночный планшет под углом 45° и аккуратно удалив существующую среду из центра каждой лунки с помощью пипетки P1000, избегая матричного гелевого кольца.
2. Для сбора органоидов повторно продуйте матричный гель, пипетируя 1 мл дезпазосодержащей среды непосредственно на матричное гелевое кольцо до тех пор, пока все кольцо не будет смещено, и перенесите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно избегать прямого контакта с лунками с покрытием Poly-HEMA. Прямой контакт может привести к загрязнению собранного материала Poly-HEMA, что может негативно сказаться на выживаемости клеток.
3. Поместите микроцентрифугу объемом 1,5 мл в инкубатор с 5%_CO2 при температуре 37 °C на срок от 30 минут до 1 часа, чтобы обеспечить полное разложение матричного геля путем диспажа.
4. Измельчите органоиды центрифугированием при давлении 800 x g в течение 5 минут при RT и удалите надосадочную жидкость с помощью микропипетки.
5. Добавьте фосфатно-солевой буфер (PBS) в органоидную гранулу и осторожно взбейте ее.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Недостаточная ресуспендия органоидной гранулы может привести к загрязнению органоидного материала остаточными диспазами или матричным гелем.
6. Гранулируйте органоиды центрифугированием при 800 x g в течение 5 минут при RT и удалите надосадочную жидкость с помощью микропипетки.
7. Быстро заморозьте гранулы органоидов, поместив каждую пробирку в раствор, содержащий сухой лед и метанол. Храните пробирку (пробирки) до будущего использования при температуре -80 °C. В качестве альтернативы извлеките лизат белка сразу после шага 1.6.
8. Ресуспендируйте гранулы органоидов в 100 мкл буфера для лизиса белка (табл. 1) на 10 мкл объема упакованной клетки. Проведите по экрану, чтобы подтвердить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При возобновлении работы после быстрой заморозки убедитесь, что буфер для лизиса белка размораживается, прежде чем удалять образцы с температуры -80 °C, так как буфер для лизиса должен быть немедленно добавлен в образцы для предотвращения активности фосфатазы и протеазы.
9. Инкубируйте образцы в буфере для лизиса белка на льду не менее 45 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проводить ультразвуковую обработку перед инкубацией на льду для повышения эффективности восстановления ядерного белка; Тем не менее, ультразвук не требуется. Если ультразвуковая обработка не проводится, перейдите к шагу 1.10.
   1. Для обработки ультразвуком погрузите трубки во влажный лед и аккуратно приложите наконечник звукового дисмембратора к микроцентрифужной трубке. Ультразвуковая обработка в течение 40 с на частоте 20 кГц.
10. Приступайте к вестерн-блоттингу, следуя установленным протоколам.

Таблица 1: Инструкция по приготовлению ключевых растворов

Рецепты
Диспазсодержащие среды	1 мг/мл диспаза + 10 мкМ ингибитор ROCK в усовершенствованном DMEM F12. Фильтр простерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм.
Диссоциативные медиа	10% FBS + 1x Пенициллин-стрептомицин в RPMI 1640. Фильтр простерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм.
Буфер для лизиса белка	RIPA буфер + ингибиторы фосфатазы + ингибиторы протеазы
Решение для блокировки	10% FBS в PBS с 0,2% Triton X-100

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
А83-01	Токрис	2939
Усовершенствованный DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010
Добавка B-27 (50x), без сыворотки	Thermo Fisher Scientific	17504044
Диспаза II, Порошок	Thermo Fisher Scientific	Телефонный номер: 17-105-041
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	сигма	Ф8667
ГлутаМАКС Термо	Научный центр Фишера	35050061
Остановка ингибитора фосфатазы	Thermo Fisher Scientific	78428
Мембранная матрица Matrigel GFR	Corning CB-	40230С
N-ацетил-L-цистеин	сигма	А9165
Нормоцин	Thermo Fisher Scientific	АНТ-НР-1
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/<бр/> мл)	Thermo Fisher Scientific	Тел.: 15-140-122
Поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (Поли-ГЕМА)	сигма	П3932-25Г
Радиоиммунопреципитативный анализ (РИПА)	Thermo Fisher Scientific	PI89901
Рекомбинантная человеческая EGF, без животных	ПепроТех	АФ-100-15
Рекомбинантный человеческий ноггин	ПепроТех	120-10С
RPMI 1640 Средний, HEPES (cs of 10)	Thermo Fisher Scientific	22400105
Звуковой Дисмембратор	Thermo Fisher Scientific	ФБ120
Тритон Х-100	сигма	Х100-5МЛ
Y-27632 дигидрохлорид (ингибитор ROCK)	Селлек Кемикал	С1049-50МГ

г.