$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Фиксация и окрашивание органоидов предстательной железы для иммуногистохимического анализа методом конфокальной микроскопии полного монтирования
- Сбор органоидов предстательной железы с 24-луночных планшетов — ВРЕМЯ: 45-60 мин<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе органоидов предстательной железы для обработки для конфокальной микроскопии крайне важно обращаться с ними осторожно, чтобы сохранить их структуру. Приведенный ниже протокол сбора предназначен для уменьшения нарушения органоидной структуры во время изоляции.
- Удалите среду из каждой лунки пластины, содержащей органоиды, наклонив пластину под углом 45°.
- Матричный гель расщепляют путем инкубации с 500 мкл среды, содержащей диспазу (табл. 1) в течение 30 мин в инкубаторе с 5%CO2 при температуре 37 °C.
- Соберите сваренную органоидную суспензию в микроцентрифужную пробирку и гранулируйте органоиды центрифугированием при 800 x g в течение 3 мин при RT. Удалите надосадочную жидкость.
- Иммунофлуоресцентное окрашивание органоидов предстательной железы в полном объеме — СРОКИ: 3-4 дня (1-5 ч/сут)
- Добавьте 500 мкл 4% параформальдегида в PBS и инкубируйте в течение 2 ч при RT с легким встряхиванием.
- Гранулируйте органоиды центрифугированием при 800 x g в течение 3 минут при RT, удалите надосадочную жидкость и промойте гранулу 1 мл PBS в течение 15 минут, осторожно встряхивая.
- Промойте гранулу, как в пункте 1.2.2, еще два раза.
- Гранулируйте органоиды центрифугированием при 800 x g в течение 3 мин при RT и удалите надосадочную жидкость. Добавьте 1 мкг/мл DAPI в раствор для блокировки (табл. 1). Выдерживать в течение 2 ч при RT или в течение ночи при 4 °C с легким встряхиванием.
- Гранулируйте органоиды центрифугированием при 800 x g в течение 3 мин при RT и удалите надосадочную жидкость. Добавьте первичное антитело (кролик анти-р63, мышиный антицитокератин 8) в блокирующий раствор и инкубируйте в течение ночи при 4 °С с легким встряхиванием.
- Гранулируйте органоиды центрифугированием при 800 x g в течение 3 мин при RT и удалите надосадочную жидкость. Промойте гранулу 1 мл PBS в течение 15 минут, осторожно встряхивая.
- Промойте гранулы, как в пункте 1.2.6, еще два раза.
- Гранулируйте органоиды центрифугированием при 800 x g в течение 3 мин при RT и удалите надосадочную жидкость. Добавьте вторичное антитело (козье антикроличьи IgG-Alexa Fluor 594, козье антимышиное IgG-Alexa Fluor 488) в блокирующий раствор и инкубируйте в течение ночи при 4 °C с легким встряхиванием.
- Гранулируйте органоиды центрифугированием при 800 x g в течение 3 минут при RT, удалите надосадочную жидкость и промойте гранулу 1 мл PBS в течение 15 минут, осторожно встряхивая.
- Промойте гранулу, как в пункте 1.2.9, еще два раза.
2. Очистка тканей и монтаж окрашенных органоидов предстательной железы для конфокальной микроскопии полного крепления — ВРЕМЯ: 7 H
- Гранулируйте органоиды центрифугированием при 800 x g в течение 3 мин при RT и удалите надосадочную жидкость.
- Добавьте 1 мл 30% сахарозы в PBS с 1% Triton X-100 и выдерживайте в течение 2 ч при RT с легким встряхиванием.
- Гранулируйте органоиды центрифугированием при 800 x g в течение 3 мин при RT и удалите надосадочную жидкость.
- Добавьте 1 мл 45% сахарозы в PBS с 1% Triton X-100 и выдерживайте в течение 2 ч при RT с легким встряхиванием.
- Гранулируйте органоиды центрифугированием при 800 x g в течение 3 мин при RT и удалите надосадочную жидкость.
- Добавьте 1 мл 60% сахарозы в PBS с 1% Triton X-100 и инкубируйте в течение 2 ч при RT с легким встряхиванием.
- Гранулируйте органоиды центрифугированием при 800 x g в течение 3 мин при RT и удалите 95% надосадочной жидкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула становится более рыхлой по мере того, как концентрация сахарозы становится выше. Рекомендуется наблюдать за окрашенными DAPI органоидами под ультрафиолетовым светом, чтобы убедиться, что они не были потеряны во время удаления надосадочной жидкости.
- Перенесите каплю оставшейся суспензии объемом 10-20 мкл на камерный покровный стекло и приступайте к конфокальной микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагменты покровного стекла могут быть размещены с любой стороны капли для использования в качестве прокладок (Рисунок 1C). Они предотвращают разрушение органоидов при наложении покровного стекла на каплю.
Таблица 1: Инструкция по приготовлению ключевых растворов
| компонент | концентрация |
| В-27 | 1х (разбавить из 50х концентрата) |
| ГлутаМАКС | 1х (разбавить из 100х концентрата) |
| N-ацетил-L-цистеин | 1,25 мМ |
| Нормоцин | 50 мкг/мл |
| Рекомбинантный человеческий EGF, не содержащий животных | 50 нг/мл |
| Рекомбинантный человеческий ноггин | 100 нг/мл |
| R-спондин 1-кондиционированная среда | 10% кондиционированная среда |
| А83-01 | 200 нМ |
| ДГТ | 1 нМ |
| Y-27632 дигидрохлорид (ингибитор ROCK) | 10 μМ |
| Усовершенствованный DMEM/F-12 | Базовые носители |
| R-спондин 1-кондиционированная среда генерируется, как описано в Drost, et al. После добавления всех компонентов, фильтр стерилизует мышиную органоидную среду с помощью фильтра 0,22 мкм. Ингибитор ROCK добавляется только во время создания культуры и прохождения органоидов. |
