Функционализированная изоляция клеток-мишеней на основе проводов: метод ex vivo для выделения раковых клеток из периферической крови с шипами

Аннотация

Источник: Chen S. et al. Предварительное обогащение клеток-мишеней и амплификация всего генома для последующей характеристики одной клетки. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы демонстрируем выделение эпителиальных раковых клеток, экспрессирующих EpCAM, из образцов периферической крови. Метод включает в себя использование медицинского провода, функционализированного антителами EpCAM, для захвата клеток-мишеней. Затем захваченные клетки извлекаются в буферный раствор.

Протокол

>ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает выделение клеток HT-29 (клеточная линия рака толстой кишки человека) из PBS или из искусственных смесей клеток HT-29 и периферической крови. Тот же эксперимент был проведен с двумя дополнительными клеточными линиями (LNCaP и VCaP) и теоретически может быть проведен со всеми клетками, экспрессирующими EpCAM.

1. Подготовка клеток-мишеней

1. Культивирование клеток и мечение клеток
   заметка: В этом протоколе клетки культивируются в колбах с культурой 75 см². Пожалуйста, отрегулируйте количество реагентов соответствующим образом, если используются другие устройства для культивирования клеток (например, чашки для культивирования 25 см², 6-луночные планшеты и т. д.). Все используемые жидкости предварительно подогреваются до 37 °C на водяной бане. Если не указано иное, все этапы протокола выполняются при комнатной температуре (RT).
   1. Культивирование клеток HT-29 в модифицированной среде McCoy's 5a с добавлением 2 мМ L-глутамина, 20 мМ Hepes, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина при 37 °C в атмосфере 5%_CO2.
   2. Когда клетки станут слитыми на 90%, удалите среду и промойте клетки 10 мл 1x PBS.
   3. Чтобы собрать клетки, добавьте в клетки 2 мл раствора для отрыва клеток (Таблица материалов и реагентов) и инкубируйте клетки в течение примерно 5 минут при 37 °C.
      заметка: Раствор для отделения содержит протеолитические и коллагенолитические ферменты в 1x PBS, 0,5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 3 мг/л фенола красного. Сократите время предварительного нагрева раствора для отслойки клеток до минимума, так как он будет неактивен через 1 ч при 37 °C. Покройте весь слой клеток для получения оптимальной отслойки клеток.
   4. Проверьте отслойку клеток с помощью инвертированного микроскопа.
   5. Перенесите все отделенные клетки в пробирку объемом 50 мл, предварительно заполненную 10 мл питательной среды для клеточных клеток (так же, как используется на шаге 1.1.1.) и повторно суспендируйте клетки с помощью пипетирования.
   6. Поместите оставшуюся суспензию ячеек на горизонтальный роликовый миксер в режиме RT и перейдите к этапу маркировки.
2. Мечение клеток-мишеней живыми клетками
   1. Разведите 1 мкл 5 мМ CFSE (поставляемого в виде диметилсульфоксида, ДМСО) в 1 мл 1x PBS, предварительно подогретого при 37 °C><, чтобы получить 5 мкМ готовый к использованию раствор для маркировки CFSE. заметка: Для достижения оптимальных результатов окрашивания используйте свежеприготовленные растворы.
   2. Приготовьте готовый к применению раствор для окрашивания ДНК (Таблица материалов и реактивов) в 1x PBS и храните его при температуре 2-6 °C в защищенном от света месте.
      заметка: Для достижения оптимальных результатов окрашивания используйте свежеприготовленные растворы.
   3. Достаньте клетки из горизонтального роликового смесителя (шаг 1.1.6.) и гранулируйте клетки при 300 x g в течение 10 мин. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 10 мл 1x PBS.
   4. Снова промойте клетки с помощью 1x PBS и повторно суспендируйте клеточную гранулу в готовом к использованию растворе для маркировки CFSE объемом 500 мкл.
   5. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 15 мин и соберите клетки после центрифугирования при 300 x g в течение 3 мин.
   6. Суспендируйте меченые клетки в 1 мл предварительно подогретой среды для культивирования клеток и дайте клеткам регенерировать при 37 °C в течение 30 минут.
   7. Соберите клетки центрифугированием при 300 x g в течение 3 минут и повторно суспендируйте клеточные гранулы в 1 мл готового к использованию раствора для окрашивания ДНК при температуре 37 °C в течение 10 минут.
   8. Гранулируйте клетки, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 4 мл 1x PBS. Оцените плотность клеток с помощью гемоцитометра и проверьте флуоресцентное мечение с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного фильтрами 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и флуоресцеин изотиоцианат (FITC) (рис. 1A и 1E).
   9. Центрифугируйте клетки при давлении 300 x g в течение 3 минут и повторно суспендируйте клеточную гранулу в соответствии с плотностью клеток, необходимой для соответствующего эксперимента, как указано в следующем разделе, и поместите на лед.

2. Зарядка провода

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть выделены из клеток-мишеней/периферической крови в миллилитровом масштабе или путем предоставления небольшого количества клеток в микролитровом масштабе. В то время как первый подход позволяет имитировать редкоклеточные условия в периферической крови, второй может быть предпочтительным способом присоединения нескольких клеток с целью оптимизации/тестирования протокола.

1. Зарядка провода с помощью большого объема ячеистых суспензий
   1. Приготовьте 2% раствор для блокирования БСА, растворив 0,8 г БСА в 40 мл 1x PBS (использование в клеточной культуре). Растворить БСА путем начального вортексирования и последующей инкубации при РТ на горизонтальном роликовом смесителе в течение 10-20 мин.
   2. Промойте пустые пробирки с ЭДТА/гепарином натрия 2 мл 2% БСА, чтобы удалить остатки антикоагулянта, и выбросьте раствор. Заблокируйте поверхность пробирки путем инкубации при RT с 5 мл 2% BSA на горизонтальном роликовом смесителе при 15 об/мин в течение 30 минут и выбросьте раствор.
   3. Разбавьте меченые элементы (раздел 1.2.) до плотности 100 000 клеток/мл и используйте 5 мл для зарядки провода.
   4. Добавьте в пробирку 5 мл меченой клеточной суспензии (всего 500 000 клеток). Избегайте образования пузырей при добавлении клеточной суспензии.
   5. Извлеките провод из отсека для хранения, а также резиновый колпачок, удерживающий провод, и промойте его в 1x PBS (Рисунок 2).
   6. Проникните в резиновый колпачок трубки ЭДТА (шаг 2.1.4.) с помощью иглы шприца (20 G) и вставьте проволоку таким образом, чтобы функциональная часть была полностью погружена в клеточную подвеску, когда колпачок снова оказывается на трубке и трубка помещается на наклонный роликовый миксер.
      заметка: Трехвинтовая функциональная часть провода должна быть покрыта ячеистой подвеской на протяжении всей зарядки.
   7. Вращайте трубки на наклонном роликовом миксере со скоростью 5 об/мин в течение 30 минут, чтобы элементы могли прикрепиться к проводу.
   8. Промойте провод 5 мл 1x PBS и храните его в темноте при температуре 2-6 °C в пробирке объемом 15 мл, содержащей 1x PBS, до визуального осмотра><. заметка: Функциональная часть провода всегда должна быть погружена в PBS, чтобы не повредить клетки.
2. Выделение клеток-мишеней из искусственных смесей с периферической кровью (альтернативный метод зарядки: 2.1. Зарядка провода с помощью большого объема ячеистых подвесок)
   1. Разбавляют меченые клетки (раздел 1.2.) для получения клеточных суспензий с высокой плотностью клеток (> 1 000 000 клеток/мл), тем самым поддерживая на низком уровне объем клеточной суспензии, добавляемой в периферическую кровь.
   2. Добавьте от 500 до 500 000 клеток к 5 мл периферической крови и перемешайте их, перевернув пробирку.
   3. Извлеките провод из отсека для хранения, снимите резиновый колпачок, удерживающий провод, и промойте его в 1x PBS.
   4. Проникните в новую крышку пробирки с нефункциональной частью устройства с помощью иглы шприца (20 G) таким образом, чтобы функциональная часть была полностью погружена в кровь с шипами, когда колпачок снова оказывается на пробирке, и трубка помещается на наклонный роликовый миксер.
      заметка: Трехвинтовая функциональная часть провода должна быть покрыта ячеистой подвеской на протяжении всей зарядки.
   5. Инкубируйте трубку на наклонном роликовом миксере при 5 об/мин в течение 30 минут при RT.
   6. Промойте провод три раза в 1x PBS и храните его в темноте в пробирке объемом 15 мл, содержащей 1x PBS, до визуального осмотра.
      заметка: Функциональная часть провода всегда должна быть погружена в воду, чтобы не повредить клетки.
3. Зарядка провода от малообъемных суспензий элементов (альтернативный метод зарядки: 2.1. Зарядка провода с помощью большого объема ячеистых подвесок)
   1. Ресуспендируйте меченые клетки со скоростью 1 000 000 клеток/мл в 1x PBS.
   2. Закрепите одноразовую стеклянную пипетку Пастера диаметром 150 мм горизонтально на штативе.
   3. Извлеките провод из отсека для хранения, но держите желтый резиновый колпачок, удерживающий провод.
   4. Поместите провод в пипетку таким образом, чтобы функционализированная часть располагалась на кончике пипетки Пастера, не касаясь стекла.
      заметка: Наконечник проволоки не должен торчать из наконечника пипетки Пастера. Не затыкайте задний конец наконечника дозатора Пастера резиновым колпачком, удерживающим провод. При плотном креплении клеточные суспензии не могут быть загружены с другой стороны в наконечник пипетки.
   5. Загрузите 15 мкл клеточной суспензии в наконечник пастеровской пипетки, покрывающей функционализированную часть проволоки.
   6. Инкубируйте проволоку в течение 10 мин. Вручную поворачивайте собранную проволоку/наконечник пипетки Пастера каждую минуту.
   7. Снимите провод с наконечника пипетки Пастера, промойте его в 5 мл 1x PBS и храните в темноте при температуре 2-6 °C в пробирке объемом 15 мл, содержащей 1x PBS, до визуального осмотра><. заметка: Функциональная часть всегда должна быть погружена в 1x PBS, чтобы не повредить клетки.

3. Подсчет ячеек на проводе

ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите функциональную часть провода погруженной в 1x PBS, чтобы не повредить ячейки.

1. С помощью смазочной ручки нарисуйте прямоугольную область на предметном стекле и добавьте 500 мкл 1x PBS.
2. Согните нефункциональную часть провода и поместите ее на предметное стекло таким образом, чтобы функциональная часть была погружена в 1x PBS.
   заметка: Подгоните площадь прямоугольника и объем 1х ПБС, чтобы полностью покрыть функциональную часть провода. Используйте двустороннюю клейкую ленту для крепления нефункциональной части провода на предметном стекле
.
3. Визуально осмотрите обе стороны провода, чтобы перечислить захваченные ячейки (рис. 1B и 1F).
   заметка: Наличие клеток определяют с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного фильтрами для DAPI и FITC. Обе стороны провода могут быть осмотрены, и количество ячеек может быть либо оценено (для большого числа ячеек), либо подсчитано (это возможно только в том случае, если к проводу подключено небольшое количество ячеек). Этот шаг можно пропустить, если перечисление ячеек не является необходимым.
4. После сканирования поместите провод обратно в трубку объемом 15 мл, содержащую 1x PBS, храните провод в темноте.
   заметка: Большая часть нефункциональной части проволоки может быть обрезана (в том числе и изгиб) и снята, облегчая хранение.

4. Отслойка и восстановление клеток-мишеней

ПРИМЕЧАНИЕ: Отделение клеток должно быть выполнено в течение 4 часов после изоляции.

1. Растворите 4 мг разделительного буферного компонента (Таблица материалов и реагентов) на мл 1x PBS и отфильтруйте раствор через стерильный фильтр 0,2 мкм, чтобы получить готовый к использованию буфер.
   заметка: Полимер проволоки состоит из гидрогеля, который функционализирован антителами против EpCAM, что позволяет связываться с клетками-мишенями, представляющими EpCAM. Высвобождающий буфер содержит углерод-кислородный протеолитический фермент, способный расщеплять гидрогель. Протеолитическое расщепление приводит к деградации полимера и, следовательно, к отслоению захваченных клеток.
2. Предварительно прогрейте разделительный буфер при 37 °C в течение 5 минут.
3. Добавьте 1,6 мл разделительного буфера, чтобы заполнить реакционную пробирку объемом 1,5 мл.
   заметка: Пробирки, рассчитанные на реакционные объемы 1,5 мл, позволяют вносить 1,6 мл, что необходимо для погружения функциональной части проволоки.
4. Инкубируйте функциональную часть проволоки в высвобождающем буфере при температуре 37 °C (водяная баня) в течение 20 мин. Используйте резиновый колпачок, поставляемый в комплекте с проволокой, вместо колпачка трубки, чтобы зафиксировать проволоку в пробирке объемом 1,5 мл, чтобы избежать загрязнения во время инкубации на водяной бане.
5. Перенесите проволочно-трубный узел в шейкер при RT и 500 об/мин на 15 мин.<бр/> заметка: Шейкер имеет орбиту 1,5 мм.
6. Поместите сборку проволоки и трубки в центрифугу и вращайте ее при давлении 300 x g в течение 10 минут.
7. Извлеките проволоку из пробирки, закройте крышку и снова центрифугируйте пробирку при давлении 300 x g в течение 10 мин.<бр/> заметка: Провод можно хранить в 1x PBS при температуре 2-6 °C в темноте для подсчета ячеек для оценки эффективности отсоединения / проверки остатков ячеек на проводе.
8. Чтобы уменьшить объем клеточной суспензии, удалите все надсадочную жидкость, кроме 100 мкл (микроманипуляция) или 300 мкл (цитоцентрифугирование и последующая лазерная микродиссекция) надосадочной жидкости и немедленно приступайте к отбору проб одиночных клеток.

Результаты

Рисунок 1: Визуализация помеченных ячеек.(A,E) Клетки перед зарядкой: Клетки помечаются CFSE и окрашиваются интеркалирующим красителем ДНК, показывающим диапазон интенсивности сигнала CFSE (зеленый). (B,F) Меченые клетки, захваченные на проводе. (C,G) Провод после процедуры отделения клеток. (

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Буфер для высвобождения Gilupi	Гилупи	ГИЛ083	Используется для отсоединения ячеек от провода
McCoy's 5A Medium (1x) с L-глютамином	Thermo Fisher Scientific	16600-082	Питательная среда, используемая для клеток HT-29, адаптирует питательную среду к клеточной линии, используемой для экспериментов
Буферный раствор HEPES (1 м)	ПАА	С11-001	Добавка для McCoy's 5A Medium
Сыворотка для плода крупного рогатого скота Голд	ПАА	А15-151	Добавка для модифицированной среды McCoy's 5a
Пенициллин-стрептомицин (100x)	Биозапад	Л0018-100	Добавка для модифицированной среды McCoy's 5a
Фосфатно-солевой буфер (1x PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-015
Аккутаза	Биозапад	Л0950-100	Раствор для отслойки клеток (клеточная культура)
Водяная баня	ГФЛ	Тип 1003	Используется для предварительного подогрева растворов
инкубатор	Thermo Fisher Scientific		Используется для инкубации клеток (клеточной культуры)
Реакционные пробирки 50 мл	ВВР	525-0403 (Английский
Роликовый миксер	Стюарт Сайентифик	СРТ6Д	Используется для крепления ячеек к проволоке, предотвращая их осаждение
Набор для пролиферации клеток CellTrace CFSE	Thermo Fisher Scientific	С34554	Используется для мечения живых клеток (цитоплазматическая метка)
Hoechst 33342	Н3570	Thermo Fisher Scientific	Используется для окрашивания ДНК (нуклеинового контрокрашивания)
Центрифуга (оборудована для хранения реакционных пробирок объемом 15 мл и 50 мл)	Thermo Fisher Scientific	Heraeus Megafuge 40R	Используется для грануляторов
Observer Z1 (флуоресцентный/лазерный микродиссекционный микроскоп)	Микровизуализация Carl Zeiss		Инвертированный (иммунофлуоресцентный) микроскоп, способный проводить лазерную микродиссекцию; Флуоресцентные микроскопы должны быть способны обнаруживать Hoechst 33342 (фильтр DAPI) и CFSE (фильтр FITC)
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Сигма-Олдрич	А4503-50Г	Используется для нанесения покрытий на стеклянные/пластиковые поверхности
Минишейкер MS1	Сигма-Олдрич	Z404039	Используется для вортексинга
Вакуумные трубки ЭДТА (или Na-гепарин)	БД	366450 (или 366480)	Используется в качестве реакционной пробирки для захвата клеток мишеней ex vivo
Detektor CANCER03 DC03	Гилупи	ГИЛ003	Функционализированный провод, способный изолировать и отсоединять EpCAM-положительные ячейки (также называемые catch&release, C&R)
Иглы для шприцев (G20)	ВВР	613-0554	Используется для прокола резиновых колпачков, чтобы пропустить через них нефункциональную часть C&R
Камера Нойбауэра	Рот	Т729.1	Используется для подсчета ячеек
Пастеровские пипетки 150 мм	Волак	Д810	Используется для малообъемного нанесения ячеек в C&R
Ручка для смазки	Дако	С2002	Используется на стеклянных предметных стеклах для удержания подвеса ячеек на месте
Стерильный шприцевой фильтр (0,2 мкм)	Корнинг	431219	Для фильтрации свежеприготовленного Gilupi Release Buffer
Delfia PlateShaker	Перкин Элмер	1296-003	Используется для возбуждения при отслойке клеток
Пробирки объемом 1,5 мл	Эппендорф	30,125,150
Комплект Ampli1 WGA	Кремниевые биосистемы		Заказать через Silicon Biosystems
Axiovert M200 с микроманипулятором MMJ и CellTram vario	Zeiss/Eppendorf		Используйте микроманипуляции под рукой
Микрокапилляры (диаметр 25 мкм), CustomTip тип I	Эппендорф	930001201	Используется для микроманипуляций с клетками
0,2 мл ПЦР-пробирок	Биозим	710920
Цитоцентрифуги и оборудование	Хеттих	Универсальный 32	Используйте цитоцентрифугу под рукой
Термоамплификатор	Био-Рад	Диада двигателя ДНК	Можно использовать любой термоамплификатор с подогреваемой крышкой
Микроцентрифуга	Рот	СХ73.1	Используйте настольную центрифугу под рукой
МембранаSlide 1.0 ПЭТ	Цейсс	415101-4401-050	Стеклянные предметные стекла с мембранным покрытием, используемые для лазерной микродиссекции