>ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает выделение клеток HT-29 (клеточная линия рака толстой кишки человека) из PBS или из искусственных смесей клеток HT-29 и периферической крови. Тот же эксперимент был проведен с двумя дополнительными клеточными линиями (LNCaP и VCaP) и теоретически может быть проведен со всеми клетками, экспрессирующими EpCAM.
1. Подготовка клеток-мишеней
- Культивирование клеток и мечение клеток
заметка: В этом протоколе клетки культивируются в колбах с культурой 75 см². Пожалуйста, отрегулируйте количество реагентов соответствующим образом, если используются другие устройства для культивирования клеток (например, чашки для культивирования 25 см², 6-луночные планшеты и т. д.). Все используемые жидкости предварительно подогреваются до 37 °C на водяной бане. Если не указано иное, все этапы протокола выполняются при комнатной температуре (RT).
- Культивирование клеток HT-29 в модифицированной среде McCoy's 5a с добавлением 2 мМ L-глутамина, 20 мМ Hepes, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина при 37 °C в атмосфере 5%CO2.
- Когда клетки станут слитыми на 90%, удалите среду и промойте клетки 10 мл 1x PBS.
- Чтобы собрать клетки, добавьте в клетки 2 мл раствора для отрыва клеток (Таблица материалов и реагентов) и инкубируйте клетки в течение примерно 5 минут при 37 °C.
заметка: Раствор для отделения содержит протеолитические и коллагенолитические ферменты в 1x PBS, 0,5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 3 мг/л фенола красного. Сократите время предварительного нагрева раствора для отслойки клеток до минимума, так как он будет неактивен через 1 ч при 37 °C. Покройте весь слой клеток для получения оптимальной отслойки клеток.
- Проверьте отслойку клеток с помощью инвертированного микроскопа.
- Перенесите все отделенные клетки в пробирку объемом 50 мл, предварительно заполненную 10 мл питательной среды для клеточных клеток (так же, как используется на шаге 1.1.1.) и повторно суспендируйте клетки с помощью пипетирования.
- Поместите оставшуюся суспензию ячеек на горизонтальный роликовый миксер в режиме RT и перейдите к этапу маркировки.
- Мечение клеток-мишеней живыми клетками
- Разведите 1 мкл 5 мМ CFSE (поставляемого в виде диметилсульфоксида, ДМСО) в 1 мл 1x PBS, предварительно подогретого при 37 °C><, чтобы получить 5 мкМ готовый к использованию раствор для маркировки CFSE.
заметка: Для достижения оптимальных результатов окрашивания используйте свежеприготовленные растворы.
- Приготовьте готовый к применению раствор для окрашивания ДНК (Таблица материалов и реактивов) в 1x PBS и храните его при температуре 2-6 °C в защищенном от света месте.
заметка: Для достижения оптимальных результатов окрашивания используйте свежеприготовленные растворы.
- Достаньте клетки из горизонтального роликового смесителя (шаг 1.1.6.) и гранулируйте клетки при 300 x g в течение 10 мин. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 10 мл 1x PBS.
- Снова промойте клетки с помощью 1x PBS и повторно суспендируйте клеточную гранулу в готовом к использованию растворе для маркировки CFSE объемом 500 мкл.
- Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 15 мин и соберите клетки после центрифугирования при 300 x g в течение 3 мин.
- Суспендируйте меченые клетки в 1 мл предварительно подогретой среды для культивирования клеток и дайте клеткам регенерировать при 37 °C в течение 30 минут.
- Соберите клетки центрифугированием при 300 x g в течение 3 минут и повторно суспендируйте клеточные гранулы в 1 мл готового к использованию раствора для окрашивания ДНК при температуре 37 °C в течение 10 минут.
- Гранулируйте клетки, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 4 мл 1x PBS. Оцените плотность клеток с помощью гемоцитометра и проверьте флуоресцентное мечение с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного фильтрами 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и флуоресцеин изотиоцианат (FITC) (рис. 1A и 1E).
- Центрифугируйте клетки при давлении 300 x g в течение 3 минут и повторно суспендируйте клеточную гранулу в соответствии с плотностью клеток, необходимой для соответствующего эксперимента, как указано в следующем разделе, и поместите на лед.
2. Зарядка провода
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть выделены из клеток-мишеней/периферической крови в миллилитровом масштабе или путем предоставления небольшого количества клеток в микролитровом масштабе. В то время как первый подход позволяет имитировать редкоклеточные условия в периферической крови, второй может быть предпочтительным способом присоединения нескольких клеток с целью оптимизации/тестирования протокола.
- Зарядка провода с помощью большого объема ячеистых суспензий
- Приготовьте 2% раствор для блокирования БСА, растворив 0,8 г БСА в 40 мл 1x PBS (использование в клеточной культуре). Растворить БСА путем начального вортексирования и последующей инкубации при РТ на горизонтальном роликовом смесителе в течение 10-20 мин.
- Промойте пустые пробирки с ЭДТА/гепарином натрия 2 мл 2% БСА, чтобы удалить остатки антикоагулянта, и выбросьте раствор. Заблокируйте поверхность пробирки путем инкубации при RT с 5 мл 2% BSA на горизонтальном роликовом смесителе при 15 об/мин в течение 30 минут и выбросьте раствор.
- Разбавьте меченые элементы (раздел 1.2.) до плотности 100 000 клеток/мл и используйте 5 мл для зарядки провода.
- Добавьте в пробирку 5 мл меченой клеточной суспензии (всего 500 000 клеток). Избегайте образования пузырей при добавлении клеточной суспензии.
- Извлеките провод из отсека для хранения, а также резиновый колпачок, удерживающий провод, и промойте его в 1x PBS (Рисунок 2).
- Проникните в резиновый колпачок трубки ЭДТА (шаг 2.1.4.) с помощью иглы шприца (20 G) и вставьте проволоку таким образом, чтобы функциональная часть была полностью погружена в клеточную подвеску, когда колпачок снова оказывается на трубке и трубка помещается на наклонный роликовый миксер.
заметка: Трехвинтовая функциональная часть провода должна быть покрыта ячеистой подвеской на протяжении всей зарядки.
- Вращайте трубки на наклонном роликовом миксере со скоростью 5 об/мин в течение 30 минут, чтобы элементы могли прикрепиться к проводу.
- Промойте провод 5 мл 1x PBS и храните его в темноте при температуре 2-6 °C в пробирке объемом 15 мл, содержащей 1x PBS, до визуального осмотра><.
заметка: Функциональная часть провода всегда должна быть погружена в PBS, чтобы не повредить клетки.
- Выделение клеток-мишеней из искусственных смесей с периферической кровью (альтернативный метод зарядки: 2.1. Зарядка провода с помощью большого объема ячеистых подвесок)
- Разбавляют меченые клетки (раздел 1.2.) для получения клеточных суспензий с высокой плотностью клеток (> 1 000 000 клеток/мл), тем самым поддерживая на низком уровне объем клеточной суспензии, добавляемой в периферическую кровь.
- Добавьте от 500 до 500 000 клеток к 5 мл периферической крови и перемешайте их, перевернув пробирку.
- Извлеките провод из отсека для хранения, снимите резиновый колпачок, удерживающий провод, и промойте его в 1x PBS.
- Проникните в новую крышку пробирки с нефункциональной частью устройства с помощью иглы шприца (20 G) таким образом, чтобы функциональная часть была полностью погружена в кровь с шипами, когда колпачок снова оказывается на пробирке, и трубка помещается на наклонный роликовый миксер.
заметка: Трехвинтовая функциональная часть провода должна быть покрыта ячеистой подвеской на протяжении всей зарядки.
- Инкубируйте трубку на наклонном роликовом миксере при 5 об/мин в течение 30 минут при RT.
- Промойте провод три раза в 1x PBS и храните его в темноте в пробирке объемом 15 мл, содержащей 1x PBS, до визуального осмотра.
заметка: Функциональная часть провода всегда должна быть погружена в воду, чтобы не повредить клетки.
- Зарядка провода от малообъемных суспензий элементов (альтернативный метод зарядки: 2.1. Зарядка провода с помощью большого объема ячеистых подвесок)
- Ресуспендируйте меченые клетки со скоростью 1 000 000 клеток/мл в 1x PBS.
- Закрепите одноразовую стеклянную пипетку Пастера диаметром 150 мм горизонтально на штативе.
- Извлеките провод из отсека для хранения, но держите желтый резиновый колпачок, удерживающий провод.
- Поместите провод в пипетку таким образом, чтобы функционализированная часть располагалась на кончике пипетки Пастера, не касаясь стекла.
заметка: Наконечник проволоки не должен торчать из наконечника пипетки Пастера. Не затыкайте задний конец наконечника дозатора Пастера резиновым колпачком, удерживающим провод. При плотном креплении клеточные суспензии не могут быть загружены с другой стороны в наконечник пипетки.
- Загрузите 15 мкл клеточной суспензии в наконечник пастеровской пипетки, покрывающей функционализированную часть проволоки.
- Инкубируйте проволоку в течение 10 мин. Вручную поворачивайте собранную проволоку/наконечник пипетки Пастера каждую минуту.
- Снимите провод с наконечника пипетки Пастера, промойте его в 5 мл 1x PBS и храните в темноте при температуре 2-6 °C в пробирке объемом 15 мл, содержащей 1x PBS, до визуального осмотра><.
заметка: Функциональная часть всегда должна быть погружена в 1x PBS, чтобы не повредить клетки.
3. Подсчет ячеек на проводе
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите функциональную часть провода погруженной в 1x PBS, чтобы не повредить ячейки.
- С помощью смазочной ручки нарисуйте прямоугольную область на предметном стекле и добавьте 500 мкл 1x PBS.
- Согните нефункциональную часть провода и поместите ее на предметное стекло таким образом, чтобы функциональная часть была погружена в 1x PBS.
заметка: Подгоните площадь прямоугольника и объем 1х ПБС, чтобы полностью покрыть функциональную часть провода. Используйте двустороннюю клейкую ленту для крепления нефункциональной части провода на предметном стекле .
- Визуально осмотрите обе стороны провода, чтобы перечислить захваченные ячейки (рис. 1B и 1F).
заметка: Наличие клеток определяют с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного фильтрами для DAPI и FITC. Обе стороны провода могут быть осмотрены, и количество ячеек может быть либо оценено (для большого числа ячеек), либо подсчитано (это возможно только в том случае, если к проводу подключено небольшое количество ячеек). Этот шаг можно пропустить, если перечисление ячеек не является необходимым.
- После сканирования поместите провод обратно в трубку объемом 15 мл, содержащую 1x PBS, храните провод в темноте.
заметка: Большая часть нефункциональной части проволоки может быть обрезана (в том числе и изгиб) и снята, облегчая хранение.
4. Отслойка и восстановление клеток-мишеней
ПРИМЕЧАНИЕ: Отделение клеток должно быть выполнено в течение 4 часов после изоляции.
- Растворите 4 мг разделительного буферного компонента (Таблица материалов и реагентов) на мл 1x PBS и отфильтруйте раствор через стерильный фильтр 0,2 мкм, чтобы получить готовый к использованию буфер.
заметка: Полимер проволоки состоит из гидрогеля, который функционализирован антителами против EpCAM, что позволяет связываться с клетками-мишенями, представляющими EpCAM. Высвобождающий буфер содержит углерод-кислородный протеолитический фермент, способный расщеплять гидрогель. Протеолитическое расщепление приводит к деградации полимера и, следовательно, к отслоению захваченных клеток.
- Предварительно прогрейте разделительный буфер при 37 °C в течение 5 минут.
- Добавьте 1,6 мл разделительного буфера, чтобы заполнить реакционную пробирку объемом 1,5 мл.
заметка: Пробирки, рассчитанные на реакционные объемы 1,5 мл, позволяют вносить 1,6 мл, что необходимо для погружения функциональной части проволоки.
- Инкубируйте функциональную часть проволоки в высвобождающем буфере при температуре 37 °C (водяная баня) в течение 20 мин. Используйте резиновый колпачок, поставляемый в комплекте с проволокой, вместо колпачка трубки, чтобы зафиксировать проволоку в пробирке объемом 1,5 мл, чтобы избежать загрязнения во время инкубации на водяной бане.
- Перенесите проволочно-трубный узел в шейкер при RT и 500 об/мин на 15 мин.<бр/>
заметка: Шейкер имеет орбиту 1,5 мм.
- Поместите сборку проволоки и трубки в центрифугу и вращайте ее при давлении 300 x g в течение 10 минут.
- Извлеките проволоку из пробирки, закройте крышку и снова центрифугируйте пробирку при давлении 300 x g в течение 10 мин.<бр/>
заметка: Провод можно хранить в 1x PBS при температуре 2-6 °C в темноте для подсчета ячеек для оценки эффективности отсоединения / проверки остатков ячеек на проводе.
- Чтобы уменьшить объем клеточной суспензии, удалите все надсадочную жидкость, кроме 100 мкл (микроманипуляция) или 300 мкл (цитоцентрифугирование и последующая лазерная микродиссекция) надосадочной жидкости и немедленно приступайте к отбору проб одиночных клеток.
