Забор образцов одиночных клеток с помощью микроманипуляций: метод выделения одиночных клеток из суспензии раковых клеток

Аннотация

Источник: Chen S. et al. Предварительное обогащение клеток-мишеней и амплификация всего генома для последующей характеристики одной клетки. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео описывается техника выделения отдельных клеток из пула целевых клеток для проведения последующего анализа. В этом методе используется микроманипулятор, установленный на микроскопе, для высокоточной изоляции одной клетки-мишени.

Протокол

1. Выборка одиночных клеток

1. Микроманипуляции
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить последующее применение, такое как анализ всего генома (WGA), изолированные одиночные клетки будут добавлены к 2 мкл мастер-смеси для лизиса клеток. Приготовьте мастер-смесь в соответствии с количеством обрабатываемых ячеек. Рассчитайте дополнительные объемы потерь из-за пипетирования и поместите мастер-смесь для лизиса клеток на лед.
   1. Готовим мастер-смесь для лизиса клеток (компоненты набора WGA, Таблицы материалов и реактивов). Вкратце смешайте 2,0 мкл реакционного буфера, 1,3 мкл октилфеноксиэтоксиэтанола (10% раствор), 1,3 мкл 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил) фенил-полиэтиленгликоля (10% раствор), 2,6 мкл раствора протеиназы К и 12,8 мкл воды, не содержащей РНКазы/ДНКазы, чтобы получить мастер-смесь для 10 образцов (общий объем 20 мкл).<бр/> заметка: Для большего количества образцов соответственно увеличьте объемы.      
   2. С помощью смазочного карандаша нарисуйте область, удерживающую суспензию ячейки на месте. Отрегулируйте площадь и объем, если плотность ячеек слишком высока (т.е. отметьте большую площадь на предметном стекле, загрузите 1x PBS и аликвоту клеточной суспензии).
   3. Пипеткой нанесите всю целевую клеточную суспензию на предметное стекло.
   4. Перенесите предметное стекло в микроскоп, оснащенный микроманипулятором. Дайте ячейкам отстояться в течение 5 минут.
   5. Подготовьте 0,2 мл ПЦР-пробирок с 2,0 мкл мастер-смеси для лизиса клеток (приготовленной на шаге 1.1.1.) и храните ее на льду.
   6. Соберите отдельные клетки в 1 мкл 1x PBS с помощью микроманипулятора и перенесите клетки в пробирку, содержащую мастер-смесь для лизиса клеток.
      заметка: Для переноса микрообработанных клеток в буфер для лизиса клеток, поместите капилляр непосредственно в 2 мкл лизисного раствора и выбрасывайте до тех пор, пока не появятся пузырьки.
   7. Кратковременно уменьшите температуру образца при 2000 x g в течение 3 с с помощью настольной микрофуги, чтобы собрать всю жидкость на дне пробирки. Поместите образцы на лед.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фосфатно-солевой буфер (1x PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-015
Вакуумные трубки ЭДТА (или Na-гепарин)	БД	366450 (или 366480)	Используется в качестве реакционной пробирки для захвата клеток мишеней ex vivo
Пастеровские пипетки 150 мм	Волак	Д810	Используется для малообъемного нанесения ячеек в C&R
Ручка для смазки	Дако	С2002	Используется на стеклянных предметных стеклах для удержания подвеса ячеек на месте
Axiovert M200 с микроманипулятором MMJ и CellTram vario	Zeiss/Eppendorf		Используйте микроманипуляции под рукой
Микрокапилляры (диаметр 25 мкм), CustomTip тип I	Эппендорф	930001201	Используется для микроманипуляций с клетками
0,2 мл ПЦР-пробирок	Биозим	710920