Method Article

Отбор проб одиночных клеток с помощью микродиссекции с лазерным захватом: метод забора клеток-мишеней из гетерогенной клеточной популяции

April 30th, 2023

In This Article

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Chen S. et al. Предварительное обогащение клеток-мишеней и амплификация всего генома для последующей характеристики одной клетки. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео описывается техника получения одной клетки из гетерогенной клеточной популяции с помощью микродиссекции лазерного захвата. Одна изолированная клетка может быть использована для дальнейших геномных исследований или исследований рака.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выборка одиночных клеток

  1. Лазерная микродиссекция
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одиночные клетки будут добавлены в 4,5 мкл мастер-смеси для лизиса клеток (компоненты набора WGA, Таблицы материалов и реагентов) для WGA.
    1. Приготовьте мастер-смесь для лизиса клеток по Czyż et al., смешав 5,0 мкл реакционного буфера, 1,3 мкл октилфеноксиэтоксиэтанола (10% раствор), 1,3 мкл 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-полиэтиленгликоля (10% раствор), соответственно, 2,6 мкл раствора протеинады К и 34,8 мкл воды, не содержащей РНКазы/ДНКазы, для получения мастер-смеси на 10 образцов (общий объем ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
McCoy's 5A Medium (1x) с L-глютаминомThermo Fisher Scientific16600-082Питательная среда, используемая для клеток HT-29, адаптирует питательную среду к клеточной линии, используемой для экспериментов
Буферный раствор HEPES (1 м)ПААС11-001Добавка для McCoy's 5A Medium
Фетальная бычья сыворотка золотаяПААА15-151Добавка для модифицированной среды McCoy's 5a
Пенициллин-стрептомицин (100x)БиозападЛ0018-100Добавка для модифицированной среды McCoy's 5a
Фосфатно-солевой буфер (1x PBS)Thermo Fisher Scientific10010-015
АккутазаБиозападЛ0950-100Раствор для отслойки клеток (клеточная культура)
Водяная баняГФЛТип 1003Используется для предварительного подогрева растворов
инкубаторThermo Fisher ScientificИспользуется для инкубации клеток (клеточной культуры)
Реакционные пробирки 50 млВВР525-0403 (Английский
Роликовый миксерСтюарт СайентификСРТ6ДИспользуется для крепления ячеек к проволоке, предотвращая их осаждение
Набор для пролиферации клеток CellTrace CFSEThermo Fisher ScientificС34554Используется для мечения живых клеток (цитоплазматическая метка)
Hoechst 33342Н3570Thermo Fisher ScientificИспользуется для окрашивания ДНК (нуклеинового контрокрашивания)
Центрифуга (оборудована для хранения реакционных пробирок объемом 15 мл и 50 мл)Thermo Fisher ScientificHeraeus Megafuge 40RИспользуется для грануляторов
Observer Z1 (флуоресцентный/лазерный микродиссекционный микроскоп)Микровизуализация Carl ZeissИнвертированный (иммунофлуоресцентный) микроскоп, способный проводить лазерную микродиссекцию; Флуоресцентные микроскопы должны быть способны обнаруживать Hoechst 33342 (фильтр DAPI) и CFSE (фильтр FITC)
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Сигма-ОлдричА4503-50ГИспользуется для нанесения покрытий на стеклянные/пластиковые поверхности
Минишейкер MS1Сигма-ОлдричZ404039Используется для вортексинга
Detektor CANCER03 DC03ГилупиГИЛ003Функционализированный провод, способный изолировать и отсоединять EpCAMположительные ячейки (также называемые «поймай и отпусти», C&R)
Иглы для шприцев (G20)ВВР613-0554Используется для прокола резиновых колпачков, чтобы пропустить через них нефункциональную часть C&R
Камера НойбауэраРотТ729.1Используется для подсчета ячеек
Пастеровские пипетки 150 ммВолакД810Используется для малообъемного нанесения ячеек в C&R
Ручка для смазкиДакоС2002Используется на стеклянных предметных стеклах для удержания подвеса ячеек на месте
Delfia PlateShakerПеркин Элмер1296-003Используется для возбуждения при отслойке клеток
Пробирки объемом 1,5 млЭппендорф30,125,150
Комплект Ampli1 WGAКремниевые биосистемыЗаказать через Silicon Biosystems
0,2 мл ПЦР-пробирокБиозим710920
Цитоцентрифуги и оборудованиеХеттихУниверсальный 32Используйте цитоцентрифугу под рукой
ТермоамплификаторБио-РадДиада двигателя ДНКМожно использовать любой термоамплификатор с подогреваемой крышкой
МикроцентрифугаРотСХ73.1Используйте настольную центрифугу под рукой
УФ-страталинкер 1800Стратагена400072Используйте сшиватель ДНК под рукой
)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser Capture MicrodissectionSingle Cell IsolationCytocentrifuge TechniqueCell Suspension PreparationMembrane Coated SlideUV Light TreatmentCell Lysis Master MixPCR Tube CollectionHeterogeneous Cell PopulationTarget Cell Harvesting

Related Articles