Отбор проб одиночных клеток с помощью микродиссекции с лазерным захватом: метод забора клеток-мишеней из гетерогенной клеточной популяции

Abstract

Источник: Chen S. et al. Предварительное обогащение клеток-мишеней и амплификация всего генома для последующей характеристики одной клетки. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео описывается техника получения одной клетки из гетерогенной клеточной популяции с помощью микродиссекции лазерного захвата. Одна изолированная клетка может быть использована для дальнейших геномных исследований или исследований рака.

Protocol

1. Выборка одиночных клеток

1. Лазерная микродиссекция
   ПРИМЕЧАНИЕ: Одиночные клетки будут добавлены в 4,5 мкл мастер-смеси для лизиса клеток (компоненты набора WGA, Таблицы материалов и реагентов) для WGA.
   1. Приготовьте мастер-смесь для лизиса клеток по Czyż et al., смешав 5,0 мкл реакционного буфера, 1,3 мкл октилфеноксиэтоксиэтанола (10% раствор), 1,3 мкл 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-полиэтиленгликоля (10% раствор), соответственно, 2,6 мкл раствора протеинады К и 34,8 мкл воды, не содержащей РНКазы/ДНКазы, для получения мастер-смеси на 10 образцов (общий объем 45 мкл). Выложите мастер-смесь на лед.
      заметка: Для большего количества образцов соответственно увеличьте объемы.
   2. УФ-обработка предметных стекол с мембранным покрытием подходит для лазерной микродиссекции. Поместите предметные стекла в устройство для сшивания ДНК и подвергните их воздействию самого высокого ультрафиолета в течение примерно 10 минут.
   3. Соберите предметное стекло с мембранным покрытием в цитоцентрифугу и цитоспинируйте всю клеточную суспензию при 300 x g в течение 5 мин.<бр/> заметка: При использовании жидкостной системы, в которой клетки цитоцентрифугируются на скользящем растворе, удаляют надосадочную жидкость после цитоцентрифугирования и применяют сухой отжим при 1140 x g в течение 1 мин.
   4. Непосредственно приступайте к лазерной микродиссекции или дайте цитоспинам высохнуть на воздухе в течение ночи и заморозьте образцы при температуре -20 °C для длительного хранения.
   5. Пипеткой нанесите 4,5 мкл мастер-смеси для лизиса клеток в колпачок ПЦР-пробирки объемом 0,2 мл и соберите отдельные клетки с помощью лазерной микродиссекции.
   6. Извлеките ПЦР-пробирку из лазерного микродиссекционного микроскопа и закройте пробирку. Соберите всю жидкость на дне пробирки с помощью короткого отжима и поместите образец на лед.
   7. Продолжайте работу с одноклеточной WGA или храните изолированные образцы при температуре -80 °C до 1 месяца перед дальнейшей обработкой.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy's 5A Medium (1x) с L-глютамином	Thermo Fisher Scientific	16600-082	Питательная среда, используемая для клеток HT-29, адаптирует питательную среду к клеточной линии, используемой для экспериментов
Буферный раствор HEPES (1 м)	ПАА	С11-001	Добавка для McCoy's 5A Medium
Фетальная бычья сыворотка золотая	ПАА	А15-151	Добавка для модифицированной среды McCoy's 5a
Пенициллин-стрептомицин (100x)	Биозапад	Л0018-100	Добавка для модифицированной среды McCoy's 5a
Фосфатно-солевой буфер (1x PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-015
Аккутаза	Биозапад	Л0950-100	Раствор для отслойки клеток (клеточная культура)
Водяная баня	ГФЛ	Тип 1003	Используется для предварительного подогрева растворов
инкубатор	Thermo Fisher Scientific		Используется для инкубации клеток (клеточной культуры)
Реакционные пробирки 50 мл	ВВР	525-0403 (Английский
Роликовый миксер	Стюарт Сайентифик	СРТ6Д	Используется для крепления ячеек к проволоке, предотвращая их осаждение
Набор для пролиферации клеток CellTrace CFSE	Thermo Fisher Scientific	С34554	Используется для мечения живых клеток (цитоплазматическая метка)
Hoechst 33342	Н3570	Thermo Fisher Scientific	Используется для окрашивания ДНК (нуклеинового контрокрашивания)
Центрифуга (оборудована для хранения реакционных пробирок объемом 15 мл и 50 мл)	Thermo Fisher Scientific	Heraeus Megafuge 40R	Используется для грануляторов
Observer Z1 (флуоресцентный/лазерный микродиссекционный микроскоп)	Микровизуализация Carl Zeiss		Инвертированный (иммунофлуоресцентный) микроскоп, способный проводить лазерную микродиссекцию; Флуоресцентные микроскопы должны быть способны обнаруживать Hoechst 33342 (фильтр DAPI) и CFSE (фильтр FITC)
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Сигма-Олдрич	А4503-50Г	Используется для нанесения покрытий на стеклянные/пластиковые поверхности
Минишейкер MS1	Сигма-Олдрич	Z404039	Используется для вортексинга
Detektor CANCER03 DC03	Гилупи	ГИЛ003	Функционализированный провод, способный изолировать и отсоединять EpCAMположительные ячейки (также называемые «поймай и отпусти», C&R)
Иглы для шприцев (G20)	ВВР	613-0554	Используется для прокола резиновых колпачков, чтобы пропустить через них нефункциональную часть C&R
Камера Нойбауэра	Рот	Т729.1	Используется для подсчета ячеек
Пастеровские пипетки 150 мм	Волак	Д810	Используется для малообъемного нанесения ячеек в C&R
Ручка для смазки	Дако	С2002	Используется на стеклянных предметных стеклах для удержания подвеса ячеек на месте
Delfia PlateShaker	Перкин Элмер	1296-003	Используется для возбуждения при отслойке клеток
Пробирки объемом 1,5 мл	Эппендорф	30,125,150
Комплект Ampli1 WGA	Кремниевые биосистемы		Заказать через Silicon Biosystems
0,2 мл ПЦР-пробирок	Биозим	710920
Цитоцентрифуги и оборудование	Хеттих	Универсальный 32	Используйте цитоцентрифугу под рукой
Термоамплификатор	Био-Рад	Диада двигателя ДНК	Можно использовать любой термоамплификатор с подогреваемой крышкой
Микроцентрифуга	Рот	СХ73.1	Используйте настольную центрифугу под рукой
УФ-страталинкер 1800	Стратагена	400072	Используйте сшиватель ДНК под рукой