Внутрипростатическая инъекция раковых клеток: техника доставки раковых клеток для создания мышиной модели ортотопического рака предстательной железы

Аннотация

Источник: Anker, J. F. et al. Биолюминесцентная и флуоресцентная ортотопическая сингенная мышиная модель андроген-зависимого и кастрационно-резистентного рака предстательной железы. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы демонстрируем процедуру введения внутрипростатической инъекции клеток рака предстательной железы в мышиную модель. Ортотопические мышиные модели могут быть использованы для изучения происхождения заболевания и реакции на лечебную терапию в неинвазивной и клинически значимой среде.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Предоперационная подготовка мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение мышей в университетском здании для животных по крайней мере за неделю до операции, чтобы обеспечить адекватную адаптацию и свести к минимуму стресс животных. Шаги 1.1-1.6 выполняет ассистент хирурга. Все последующие хирургические шаги выполняются хирургом с использованием стерильных перчаток и хирургических инструментов стерильной техники.

1. Обезболивайте мышей изофлураном (2-5% для индукции через камеру, 1-3% для поддержания через носовой конус). Проверьте полную индукцию потерей рефлекса защемления пальца ноги.
2. Взвесьте мышей и введите не менее 0,05 мг/кг анальгетика бупренорфина s.c.
   заметка: Вес мыши ≥20 г идеально подходит для успешных внутрипростатических инъекций.
3. Нанесите смазку офтальмологической мазью на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
4. Сбрейте всю шерсть с живота.
5. Простерилизуйте брюшную полость с помощью трех круговых применений хирургического скраба с использованием стерильных неадгезивных салфеток с последующим нанесением стерильных спиртовых салфеток. Дайте животу высохнуть.
   заметка: Для остальной части хирургической процедуры необходимо использовать только стерильные перчатки и хирургические инструменты для контакта со стерилизованным брюшной полостью мыши.
6. Перенесите мышь лежа на чистую поверхность на грелку прямо под объектив чистого хирургического микроскопа.
7. Накройте мышь стерильной простыней с небольшим отверстием, вырезанным над брюшком.

2. Интрапростатическая инъекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все хирургические операции в стерильных условиях. Регулировка микроскопа, положения мыши или любого другого нестерильного объекта должна выполняться с дополнительной помощью.

1. Выполните разрез наружной поверхности кожи примерно на 1 см по средней линии живота, выше полового члена и препуциальных желез (рисунок 1D).
2. Отделите соединительную ткань между наружной кожей живота и внутренней мускулатурой живота, открыв ножницы между слоями.
3. Выполните аналогичный разрез на внутренних мышцах живота, используя щипцы для поднятия мышц, чтобы избежать прокола кишечника или мочевого пузыря (рисунок 1D).
4. Найдите одну из двусторонних семенных пузырьков (Рисунок 1А, белый)/передних долей предстательной железы (Рисунок 1А, черный), которые часто расположены сзади, латерально и немного выше мочевого пузыря (Рисунок 1А, желтый), но это может варьироваться у разных мышей. Передние доли предстательной железы полупрозрачны и прикреплены к меньшей кривизне белых семенных пузырьков.
5. Осторожно поднимите кончик семенного пузырька с помощью тканевых щипцов Грефе, чтобы создать натяжение ткани без прокола семенного пузырька (рисунок 1E).
6. Смешайте матригельный раствор Myc-CaP с помощью языческого пипетирования (выполняемого помощником хирурга), так как клетки могут гранулироваться, и медленно отсасывайте 30 мкл (1x10⁶ клеток) в иглу, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
7. Осторожно введите скос иглы параллельно длинной оси передней доли простаты. Медленно введите 30 μL в мочку, а затем медленно втяните иглу, чтобы предотвратить утечку (Рисунок 1F). Проверьте адекватную инъекцию путем нагрубания передней доли предстательной железы (Рисунок 1G).
8. Осторожно удерживайте семенной пузырь и долю предстательной железы за пределами мыши в течение примерно 30 с, чтобы матригеля частично затвердела в доле. В течение этого времени соберите любую утечку клеточного раствора в брюшной полости с помощью стерильного аппликатора с полиэфирным наконечником, чтобы предотвратить развитие неортотопической опухоли без давления на введенную долю предстательной железы.
9. Осторожно верните семенной пузырь и введенную долю предстательной железы в брюшную полость, не оказывая давления на мочку. Замените любые внешние ткани.
10. Выполните непрерывные швы, чтобы закрыть внутренние мышцы живота с помощью 5-0 викрила, рассасывающихся игольчатыми нитями обратного разрезания.
11. Выполните прерывистые швы, чтобы закрыть внешнюю кожу живота нейлоновой мононитью 4-0 нерассасывающимися иглами обратного разрезания. заметка: Стерилизованные скобки толщиной 9 мм также можно использовать для закрытия наружной кожи живота. Однако, в отличие от швов, они препятствуют любому последующему сигналу биолюминесцентной и флуоресцентной визуализации опухоли.
12. Очистите все инструменты стерильными этаноловыми салфетками (открытыми помощником хирурга) и поместите их в стерилизатор со стеклянными шариками на 30 с. Дайте инструментам высохнуть, прежде чем использовать на следующей мыши.
13. Промойте шприц и иглу в стерильном физрастворе (вскрытом помощником хирурга) для предотвращения засорения остатками matrigel.
    заметка: Помощник хирурга должен присутствовать при всех операциях, выполняя всю нестерильную предоперационную подготовку мышей и послеоперационный уход за мышами, а также смешивая раствор матрицы Myc-CaP перед инъекциями. Чтобы свести к минимуму время, так как каждая процедура на мышах в предстательной железе занимает 20-30 минут, помощник хирурга может начать подготовку следующей мыши, пока хирург накладывает швы на текущую мышь.

3. Послеоперационный уход за мышами

1. Введите 1 мг/кг обезболивающего мелоксикама немедленно, через 24 ч и через 48 ч после операции.
2. Дайте мышам восстановиться в клетке без подстилки, расположенной наполовину на грелке. Наблюдайте за мышами в течение не менее 30 минут после операции, пока они не восстановятся нормальной подвижностью и активностью, после чего поместите их в чистую клетку с едой на полу клетки.
3. Кроме того, ежедневно наблюдайте за мышами на предмет правильного заживления ран, массы тела, ухода и передвижения после операции. Разделите мышей на отдельные клетки при любых признаках драки.
4. Снимите все оставшиеся швы в течение 14 дней после операции.

Результаты

Рисунок 1: Передняя доля предстательной железы, дренирование лимфатических узлов и репрезентативная техника инъекций клеток предстательной железы. Изображения (A) правой передней доли предстательной железы (черный, *), прикрепленного правого семенного пузырька (белый), правого яичка и жировой подушки (зеленый) и мочевого пузыря (желтый), (B) двусторонних парааортальн...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клеточная линия Myc-CaP	АТКС	ЦРЛ-3255	Перед использованием убедитесь, что они не содержат микоплазм
Ножницы для микрорассечения	Робоз	РС-5910
Щипцы Graege	Робоз	РС-5135
Тканевые щипцы Graefe	Робоз	РС-5150
Иглодержатель Olsen-Hegar с Шовные резаки	ФСТ	12002-12
Шприц 50 мкл 705 RN SYR	Гамильтон	7637-01	Стерилизация окисью этилена
Иглы 28 калибра Малая ступица RN H	Гамильтон	7803-02	Тип точки 4, угол 45°, длина 0,75 дюйма. Стерилизуется окисью этилена
РПМИ	Gibco	18875-093
ФБС	Gibco	10437-028 (Английский)
Карандашлин/Стрептомицин	Gibco	15140-122
ПБС	Gibco	14190-144
Базальная мембрана Matrigel матрица, без фенола красного, без LDEV	Корнинг	356237	Оттаять на льду при температуре 4°C в течение ночи Перед применением
Изофлуран	Генри Шейн	11695-0500-2 (Английский	Получено в Центре сравнительной медицины Северо-Западного университета (CCM)
Бупренорфина гидрохлорид 0,3 мг/мл		12496-0757-5 (Английский	Контролируемое вещество, приобретенное<бр /> от CCM Северо-Западного университета
Шприц 5/8 калибра 26	БД	309597	Для инъекций мелоксикама и бупренорфина
Смазка офтальмологической мазью	Акрон	17478-162-35
Бетадин хирургический скраб (повидонейод, 7,5%)	Продукция Purdue	67618-151-16
Стерильные неадгезивные прокладки	Мур Медикал	No 10775
Стерильные спиртовые салфетки	Научный центр Фишера	Тел.: 22-363-750
Хирургический микроскоп Stemi DV4	Цейсс
Стерильные аппликаторы с полиэфирными наконечниками	пуританин	25-806 1ПД
5-0 виакрил рассасывающийся игольчатый шовный материал с обратной резкой	Шовные материалы	Дж493Г
4-0 нейлоновая монфиламентная нерассасывающаяся игольчатая нить обратной резки	Шовные материалы	699H
Стерилизатор со стеклянными шариками	Инструменты для точной науки	18000-45
Стерильный физиологический раствор 0,9% натрия хлорид	Хоспира	0409-4888-02 (Английский

гг. гг. ) ) гг. )