Получение клеток хеморезистентного рака предстательной железы: процедура получения лекарственно-устойчивых раковых клеток in vitro

Аннотация

Источник: Mohr, L. et al. Генерация моделей устойчивости клеток рака предстательной железы к антимитотическому агенту доцетакселу. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео описывается протокол создания моделей устойчивых к таксану клеток рака предстательной железы. Эти модели могут помочь в изучении путей, участвующих в прогрессировании резистентности к доцетакселу у пациентов с раком предстательной железы.

Протокол

1. Генерация доцетаксел-резистентных клеток рака предстательной железы

ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите обработку клеток с использованием запаса раствора доцетаксела, используемого для определения концентрации препарата IC50 (заранее подготовьте достаточное количество материала для экспериментального использования). Родительские клетки должны выращиваться параллельно в небольшой колбе на протяжении всей процедуры и подвергаться воздействию носителя (ДМСО) в соответствующих объемах, имитирующих количества, используемые в колбах, обработанных доцетакселом.

1. Пластина DU145 или 22Rv1 ячейки в колбах размером 150 см² колбы, содержащие 20 мл среды (3,5 x 10⁶ клеток в колбе для DU145 и 6,5 x 10⁶ клеток в колбе для 22Rv1). Рекомендуется использовать от 10 до 20 колб клеток, чтобы иметь достаточное количество клеток в конце протокола.
2. Через 24 ч, когда клетки находятся на уровне около 70-80% слияния (рис. 1B, до доцетаксела), добавьте доцетаксел в концентрации IC50 (5 нМ для клеток, описанных в этом протоколе).
3. Через 72 ч отсадите лекарственную среду и добавьте свежую, не содержащую доцетаксела среду (рис. 1B, через 72 ч после приема доцетаксела). Меняйте носители каждые 3-4 дня. В течение примерно 1-2 недель резистентные клоны будут выглядеть очевидными под микроскопом (рис. 1B, 7 и 14 дней после приема доцетаксела).
4. Аспиративную среду, тщательно промойте клетки 15 мл PBS и инкубируйте с 4 мл 0,05% Трипсин-ЭДТА в течение 3-5 мин при 37 °С, чтобы оторвать клетки от поверхности колбы.
5. Ресуспендируйте трипсинизированные клетки из колбы, используя 8 мл свежей среды. Бассейн с ячейками из всех обработанных колб. Пеллетные ячейки методом центрифугирования (300 x g, 3 мин, RT).
6. Удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 20 мл свежей среды и поместите клетки в колбы по² ячейки размером 150 см (3,5 х 10^{по 6} клеток в колбе для DU145 и 6,5 х 10^{по 6} клеток в колбе для 22Rv1).
7. Через 24 ч, когда клетки находятся примерно на 70-80% конфлюенции, снова добавьте 5 нМ Доцетаксела (начальная концентрация IC50).
8. Повторите шаги с 1.3 по 1.6 в день 3.
9. Через 24 ч, когда клетки находятся примерно на 70-80% концентрации доцетаксела, обработайте их 2X IC50 доцетакселом (10 нМ для клеток, описанных в этом протоколе).
10. Повторите шаги с 1.3 по 1.8 после повышения дозы концентрации доцетаксела (25 нМ, 50 нМ, 100 нМ и 250 нМ) для получения стабильной популяции клеток, растущих в колбах при конечной максимальной концентрации. Для более высоких концентраций протокол повышения дозы может применяться в течение 6 месяцев до тех пор, пока не будет достигнута концентрация 1000 нМ (рисунок 2A).

Результаты

Рисунок 1: Создание модельных систем клеток рака предстательной железы, резистентных к доцетакселу.(A) Диаграмма, показывающая определение Docetaxel IC50 в родительских клеточных линиях рака предстательной железы DU145 и 22Rv1 (Шаг 1 протокола). Включены ожидаемые проценты жизнеспособности клеток и необходимые концентрации доцетаксела, повышающие дозу. Включены репрезентативные графи...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Элементы DU145	АТКС	ХТБ-81
Элементы 22Rv1	АТКС	ЦРЛ-2505
Доцетаксел	Селлек Кемикалс	С1148	в ДМСО (10 мМ)
Колба для культуры тканей 150см^{2}	сокол	355001
RPMI 1640 Средний	Gibco	11875093	Дополнено 10% FBS и 1% пеницилина/стрептомицина
Тональный крем B Сыворотка для плода крупного рогатого скота	Близнецы	900208
1X Фосфатно-буферный солевой раствор (ПБС)	Корнинг	21-040-СМ
0,05%Трипсин-ЭДТА	Gibco	25300-062
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15140122