1. Подготовка клеток к визуализации в реальном времени
- Выращивайте клетки CWR22Rv1, экспрессирующие зеленую флуоресцентную белок-сопряженную легкую цепь 3 (LC3-GFP) в питательных средах RPMI, содержащих 10% FBS и 1% антибиотиков, на 35-миллиметровых чашках со стеклянным дном, покрытых поли-D-лизином. Клетки должны быть покрыты с достаточной плотностью, чтобы способствовать быстрой пролиферации, но не настолько, чтобы клетки разрастались и комковались к моменту визуализации.
- Обработайте отобранные образцы клеток с помощью ADI (0,3 мкг/мл) в PBS.
- Примерно за 1 час до визуализации разведите 1,5 мкл LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) с 20 мл RPMI, содержащим 10% FBS и 1% антибиотиков. Используйте растворы, содержащие ADI, для выбранных образцов. Нагрейте всю среду до 37 °C перед добавлением в чашку для культивирования.
- Инкубируйте клетки с RPMI, содержащим LysoTracker Red DND-99, в течение 15-45 минут при 37 °C.
- Примерно за 30 минут до начала съемки включите кожух WeatherStation и дайте ему уравновеситься до 37 °C и 5%CO2 (с увлажненным воздухом).
- Промойте ячейки PBS и замените среду стандартным RPMI, содержащим только 10% FBS и 1% антибиотиков. Добавьте ADI к образцам, как указано.
- Установите 35-миллиметровые чашки для культивирования на дне покровного стекла в специальный адаптер (Applied Precision, Inc., WA) и установите их на предметный столик микроскопа. Используйте иммерсионное масло (показатель преломления 1,520) на линзе объектива 60X 1,42 NA и расположите установленную чашку для культуры на сцене.
2. Микроскопия со структурным освещением (OMX) со сверхвысоким разрешением
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол в этом разделе применяется к использованию микроскопа структурированного освещения OMX (Applied Precision, WA).
- Включите основную мощность и желаемые лазеры (410 нм, 488 нм и/или 532 нм). Подождите 20 минут, пока лазеры не станут термически стабилизированными.
- Добавьте иммерсионное масло (показатель преломления 1,516 для фиксированных образцов в режиме RT) на объектив 60X 1,42 NA. Если в капле масла видны пузырьки, очистите объектив и снова добавьте масло.
- Поместите предметное стекло на предметное стекло и при необходимости подождите 10 минут, чтобы ячейки осядли на покровном стекле.
- Инициализируйте программу сбора. Используйте флуоресцентное освещение для регулировки фокуса до тех пор, пока не станет виден четкий контур ячейки.
заметка: Следует всегда следить за тем, чтобы свести к минимуму воздействие на клетки флуоресцентного возбуждения до момента фактического получения изображения.
- Можно получить спиральное мозаичное сканирование для предварительного просмотра больших областей образца для выбора ячеек или областей интереса. Рекомендуется использовать короткое время экспозиции (1-10 мс) и низкую мощность возбуждения (0,1-1% пропускания) при сканировании образца или поиске целей.
- Идентификация аутофагосом с помощью флуоресценции GFP-LC3. Идентификация лизосом с помощью Alexa Fluor 555 anti-LAMP (лизосом-ассоциированный мембранный белок) и ядра клеток с помощью DAPI (фиксированных образцов).
- Выберите условия эксперимента, включая длину волны возбуждения, площадь изображения (например, 512x512), толщину стека, время экспозиции и процент пропускания лазера. Для изображений со сверхвысоким разрешением убедитесь, что включена опция структурированного освещения. Для деконволюционной микроскопии на OMX выберите вариант обычного освещения.
- Для получения наилучших результатов реконструкции выберите условия эксперимента таким образом, чтобы максимальное количество интенсивностей во время сбора данных составляло от 10 000 до 15 000. Если вызывает беспокойство фотообесцвечивание, можно использовать визуализацию с более низкой экспозицией (от 5 000 до 10 000). В идеале количество очков не должно уменьшаться более чем в два раза в течение всего приобретения, и следует избегать уменьшения более чем в четыре раза. При необходимости уменьшите толщину штабеля, чтобы обеспечить постоянный подсчет интенсивности. Камера насыщается на 64 000 отсчетов, поэтому максимальная интенсивность никогда не должна превышать эту отметку. Для хороших образцов мы обнаружили, что экспериментальные условия составляют 10 ~ 50 мс при 1% лазерном пропускании. Предпочтение отдается ярким и фотостабильным образцам, которые можно многократно визуализировать. Стабильное пятно требуется для покадровых снимков со сверхвысоким разрешением.
- Для снижения уровня шума рекомендуется использовать скорость считывания 95 МГц (опция со средней скоростью) и время сбора данных не менее 2 мс. Увеличенные артефакты получаются на восстановленном изображении при перемещении образца во время сбора. Из-за этого эффекта рекомендуется кратковременное воздействие для неадгезивных или быстро движущихся клеток.
- Многоканальная визуализация может выполняться одновременно или последовательно. Последовательный режим дает меньше перекрестных помех, поэтому рекомендуется использовать его.
- Чтобы уменьшить фотообесцвечивание, обычно рекомендуется сначала получать изображения с более длинными волнами возбуждения (532 нм, 488 нм, а затем 410 нм). Однако для экспериментальных результатов, показанных на рисунке 1, этот порядок был обратным (т.е. 48 нм, 532 нм и 410 нм) из-за фотостабильности этого конкретного образца.
- Установите верхний/нижний предел Z-стека, перемещая предметный столик микроскопа до тех пор, пока верх/низ клеток не окажется немного не в фокусе. Желаемое расстояние между каждым изображением должно оставаться постоянным на уровне 0,125 мкм для получения изображений со сверхвысоким разрешением, так как программное обеспечение для реконструкции принимает это значение по умолчанию.
- Реконструируйте стеки изображений с помощью SoftWorX (Applied Precision, WA) и анализируйте с помощью VoloCITY 6.0 (Perkin Elmer, MA).
