Экстракция белка и протеолиз: метод получения белков из образцов ткани опухоли предстательной железы и их ферментативного расщепления в пептиды

Аннотация

Источник: Cheng, L. C. et al. Обогащение фосфопептидом в сочетании с безметочной количественной масс-спектрометрией для исследования фосфопротеома при раке предстательной железы. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео описывается техника экстракции и переваривания белка для получения пептидов из ткани опухоли предстательной железы. Эти пептиды при дальнейшем анализе могут помочь определить новые мишени для онкотерапии.

Протокол

1. Экстракция белка

1. Приготовьте буфер для лизиса (табл. 1). (Объем зависит от количества образцов, которые необходимо собрать.)
2. Забор тканей
   1. Взвесьте опухоль и добавьте 2 мл ледяного буфера для лизиса на каждые 100 мг ткани в культуральной пробирке. (Как правило, требуется от 50 до 150 мг влажного веса тканей.)
3. Гомогенизируйте лизат с помощью ручного или настольного гомогенизатора (импульс 2 раза в течение 15 с). Очистите гомогенизатор перед первым образцом и между образцами, последовательно используя 10% отбеливателя, 70% этанола и деионизированную воду.
4. Чтобы восстановить и алкилировать, нагрейте гомогенизированные образцы до 95 °C в течение 5 минут. Затем охладите их на льду в течение 15 минут. На льду обработайте лизат ультразвуком 3 раза (т. е. импульс в течение 30 с с 60 с паузами между импульсами). На этом этапе образец не должен быть вязким или комковатым. Нагрейте лизат до 95 °C в течение 5 минут.
5. Центрифугируйте лизат в той же пробирке с помощью ротора с качающимся ведром при температуре 3 500 x g при 15 °C в течение 15 мин. Соберите надосадочную жидкость и выбросьте гранулы.
6. Определите концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда. При необходимости разбавьте лизат до 5 мг/мл с помощью буфера для лизиса. Хранить при температуре -20 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь эксперимент можно приостановить. Заморозьте образцы при температуре -80 °C и используйте их для дальнейшего анализа.

2. Переваривание лизата

1. Разбавьте образец в 12 раз, используя 100 мМ Трис (pH = 8,5), чтобы уменьшить количество гуанидиния. Разбавьте все образцы до одного объема, чтобы свести к минимуму последствия неравномерного разложения. Сохраните 12,5 г непереваренного лизата, чтобы подтвердить его на геле, окрашенном в Кумасси.
2. Для получения 5 мг белка добавьте 10 μг лизилэндопептидазы (Lys-C) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5-6 ч. Отрегулируйте pH до 8,0, добавив 1 М нетитрованного Триса (pH ~11).
3. Приготовьте 1 мг/мл трипсина, обработанного L-1-тозиламидо-2-фенилэтилхлорметилкетоном (TPCK), в 1 мМ HCl (с 20 мМ CaCl2). Добавьте трипсин в соотношении трипсин:белок 1:100 и инкубируйте при 37 °C в течение 3 часов.
4. Добавьте такое же количество свежего трипсина, как в шаге 2.3. Инкубируйте его при температуре 37 °C в течение ночи.
5. Сохраните 12,5 мкг переваренного лизата для подтверждения полного переваривания на геле, окрашенном в Кумасси.

3. Извлечение в обратной фазе

1. Запишите объем лизата. Отфильтруйте образец с помощью светофильтра емкостью 15 мл 10 кДа. Центрифугируйте образец при давлении 3 500 x g с помощью ротора с поворотным ведром (или 3 500 x g при роторе с фиксированным углом) при 15 °C до тех пор, пока объем ретентата не станет менее 250 μL (это занимает примерно 45-60 минут). Соберите проточный и выбросьте ретентат.

Таблица 1: Буферы и решения.В этой таблице приведены составы буферов и растворов, используемых в данном протоколе.

буфер	том	состав
6 М буфер для лизиса хлорида гуанидиния	50 мл	6 М гуанидиния хлорид, 100 мМ трис pH 8,5, 10 мМ трис (2-карбоксиэтил) фосфин, 40 мМ хлорацетамида, 2 мМ ортованадата натрия, 2,5 мМ пирофосфата натрия, 1 мМ β-глицерофосфата, 500 мг н-октилгликозида, сверхчистая вода к объему
100 мМ пирофосфата натрия	50 мл	2,23 г декагидрата пирофосфата натрия, ультрачистая вода по объему
1М β-глицерофосфат	50 мл	15,31 г β-глицерофосфата, сверхчистая вода по объему
5% трифторуксусная кислота	20 мл	Добавьте 1 мл 100% трифторуксусной кислоты в 19 мл ультрачистой воды
0,1% трифторуксусной кислоты	250 мл	Добавьте 5 мл 5% трифторуксусной кислоты в 245 мл сверхчистой воды
Элюирующий буфер pY	250 мл	0,1% трифторуксусная кислота, 40% ацетонитрил, сверхчистая вода по объему
Буфер элюирования pST	250 мл	0,1% трифторуксусная кислота, 50% ацетонитрил, сверхчистая вода по объему
Буфер привязки IP	200 мл	50 мМ с pH 7,4, 50 мМ хлорида натрия, сверхчистая вода по объему
25 мМ бикарбонат аммония, pH 7,5	10 мл	Растворить 19,7 мг в 10 мл стерильной ультрачистой воды, pH до 7,5 с 1 Н соляной кислотой (~10-15 μл/10 мл раствора), сделать свежим
1М фосфатный буфер, pH 7	1 000 мл	423 мл 1 М натрия дигидрофосфата, 577 мл 1 М натрия гидрофосфата
Буфер равновесия	14 мл	6,3 мл ацетонитрила, 280 мкл 5% трифторуксусной кислоты, 1740 мкл молочной кислоты, 5,68 мл ультрачистой воды
Буфер для промывки	20 мл	9 мл ацетонитрила, 400 мкл 5% трифторуксусной кислоты, 10,6 мл ультрачистой воды
Решение для масс-спектрометрии	10 мл	500 мкл ацетонитрила, 200 мкл 5% трифторуксусной кислоты, 9,3 мл сверхчистой воды
Буфер А	250 мл	5 мМ монокалийфосфата (pH 2,65), 30% ацетонитрила, 5 мМ хлорида калия, сверхчистая вода к объему
Буфер B	250 мл	5 мМ монокалийфосфата (pH 2,65), 30% ацетонитрила, 350 мМ хлорида калия, сверхчистая вода к объему
0,9% гидроксид аммония	10 мл	300 мкл 29,42% гидроксида аммония, 9,7 мл сверхчистой воды

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Сверхнизкотемпературная морозильная камера	Панасоник	МДФ-У76В
Морозильная камера -20 °C	ВВР	СКПМФ-2020
Ковш с поворотным ротором	ThermoFisher Scientific	75004377
Торцевой ротатор	ThermoFisher Scientific	415110Q
Трубки Эппендорфа с низким связыванием белков	Эппендорф	22431081
Лечение трипсином, ТПК	Уортингтон Биокемикалс	LS003740
Лизилэндопептидаза	Вако Пьюр Кемикал Индастриз, Лтд.	125-05061 (Английский
Вода MilliQ			Деионизированная вода используется для приготовления всех растворов и буферов
Звуковой Дисмембратор	Научный центр Фишера	ФБ-120	ультразвуковой аппарат
Политрон Систем ПТ	Кинематика АГ	ПТ 10-35 ГТ	гомогенизатор

)