Очистка пептидов: метод извлечения пептидов из переваренных белковых лизатов на основе RP-ВЭЖХ

Аннотация

Источник: Cheng, L. C. et al. Обогащение фосфопептидом в сочетании с безметочной количественной масс-спектрометрией для исследования фосфопротеома при раке предстательной железы. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы демонстрируем высокоэффективную жидкостную хроматографию с обратной фазой для очистки пептидов из переваренной смеси лизата белка. Эти очищенные пептиды затем лиофилизируются и хранятся для последующего применения. Анализ пептидов может помочь понять механику, участвующую в клеточной передаче сигналов и раке.

Протокол

1. Извлечение в обратной фазе

1. Начните с предварительно переваренного лизата белка в стеклянном флаконе. Отфильтруйте образец с помощью светофильтра емкостью 15 мл 10 кДа. Центрифугируйте образец при давлении 3 500 x g с помощью ротора с поворотным ведром (или 3 500 x g при роторе с фиксированным углом) при 15 °C до тех пор, пока объем ретентата не станет менее 250 мкл (это занимает примерно 45 - 60 минут). Соберите проточный и выбросьте ретентат.
   NOTE: Здесь эксперимент можно поставить на паузу. Заморозьте образцы при температуре -80 °C для последующего использования.
2. Чтобы подкислить образец, добавьте примерно 20 мкл 5% трифторуксусной кислоты (ТЖК) на мл лизата. Хорошо перемешайте их и измерьте pH образца с помощью полосок pH. Отрегулируйте pH до 2,5 с помощью 5% TFA.
3. Подсоедините более короткий конец колонны C-18 к вакуумному коллектору. Установите вакуум в диапазоне от 17 до 34 кПа (или в соответствии с инструкциями производителя). С помощью стеклянных пипеток смочите колонку 3 мл 100% ацетонитрила (ACN). Не допускайте пересыхания колонны.
4. С помощью стеклянных пипеток уравновесьте колонку 6 мл 0,1% ТФК, подаваемых в виде 2x 3 мл. Загрузите подкисленный образец в колонку. Не добавляйте более 3 мл за один раз. Отрегулируйте вакуум так, чтобы он составлял от 1 до 2 капель в секунду.
5. С помощью стеклянных пипеток промойте колонку 9 мл 0,1% TFA, нанесенных в виде 3x 3 мл. Разбавьте колонку 2 мл 40% ACN, 0,1% TFA. Соберите две фракции по 2 мл в стеклянные пробирки для культуры. Откажитесь от столбца.
6. Накройте элюированные трубки парапленкой и проделайте 3-5 отверстий на крышке с помощью иглы 20G. Заморозьте элюат на сухом льду не менее чем на 30 минут до полного застывания.
7. Лиофилизируйте дроби за ночь. На следующий день убедитесь, что образцы полностью высохли, прежде чем прекращать прием лиофилизатора. Храните пробирки в конической тубе объемом 50 мл с деликатными салфетками при температуре -80 °C.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Сверхнизкотемпературная морозильная камера	Панасоник	МДФ-У76В
Морозильная камера -20 °C	ВВР	СКПМФ-2020
Ковш с поворотным ротором	ThermoFisher Scientific	75004377
Вакуумный коллектор	Рестек	No 26080
Лиофилизатор	Лабконко	7420020
Настольный вакуумный концентратор CentriVap	Лабконко	7810010
Центробежные фильтрующие установки Amicon Ultra-15	Миллипора Сигма	UFC901024
Торцевой ротатор	ThermoFisher Scientific	415110Q
Стеклянные пробирки для культивирования	Научный центр Фишера	14-961-26
Парафильм	Научный центр Фишера	13-374-12
Игла 20G	БД	B305175
Кимвайпс	Научный центр Фишера	06-666А
Завинчивающаяся крышка криопробы	ThermoFisher Scientific	379189
Nunc 15 мл конические пробирки	ThermoFisher Scientific	Тел.: 12-565-268
Трубки Эппендорфа с низким связыванием белков	Эппендорф	22431081
Шприц объемом 3 мл	БД	309657
Трифторуксусная кислота (ТЖК)	Научный центр Фишера	ПИ-28904
Ацетонитрил (АКЦ)	Научный центр Фишера	А21-1
Вода MilliQ			Деионизированная вода, используемая для приготовления всех растворов и буферов