Обогащение фосфопептидами: метод иммунопреципитации на основе антител для отделения специфических фосфорилированных пептидов от сложных пептидных смесей

Аннотация

Источник: Cheng, L. C., et al. Обогащение фосфопептидом в сочетании с безметочной количественной масс-спектрометрией для исследования фосфопротеома при раке предстательной железы. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео мы демонстрируем иммунопреципитацию фосфопептидов на основе антител из пептидной смеси. Обогащенные фосфопептиды концентрируются в вакууме и хранятся для последующего анализа.

Протокол

1. Иммунопреципитация и обогащение pY пептидами

1. Ресуспендируйте лиофилизированный порошок очищенных пептидных расщеплений 0,5 мл ледяного буфера, связывающего иммунопреципитацию (ИП) в каждой фракции. Объедините фракции, перенеся объем ресуспензии 0,5 мл со второй фракции на первую фракцию, и сохраните наконечник пипетки. Энергично выполняйте вихревую работу (вместо пипетирования вверх и вниз), чтобы убедиться, что образец полностью растворен, прежде чем переносить его в криопробирку с завинчивающейся крышкой объемом 3,6 мл.
2. Промойте пробирки для лиофилизации еще 0,5 мл буфера для связывания IP (Таблица 1) в каждой пробирке. Перенесите раствор в пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 3,6 мл с помощью того же наконечника для дозатора, чтобы свести к минимуму потерю пробы. Повторите полоскание еще 1 раз, сделав окончательный объем ресуспензии 2 мл (на 5 мг белка). Измерьте pH образца, чтобы убедиться, что он составляет примерно 7,4. Если он слишком кислый, итерационно добавьте 10 μL 1M Tris (без титрования, pH ~11). Если он слишком основной, итерационно добавьте 10 μL разбавленного HCl (1:25 или 1:100).
3. Предварительно промойте шарики pY (для 5 мг начального лизата)
   1. На каждый образец требуется 25 г антитела 4G10 и 12,5 г антитела 27B10.4. После использования пипетки p200 с отрезанным наконечником для переноса антител в отдельные микроцентрифужные пробирки промойте антитела 450 мкл ледяного IP-связывающего буфера 2x. Центрифугируйте их при 100 x g в течение 1 минуты при 4 °C и отсасывайте надосадочную жидкость.
   2. Суспендируйте гранулы до исходной концентрации 0,5 мг/мл с использованием буфера для связывания IP. (Не закручивайте бусины.) После выделения необходимой суспензии (50 мкл суспензии антител 4G10 и 25 мкл суспензии антител 27B10,4 на образец) в одну пробирку открутите исходные центрифужные пробирки при давлении 200 x g в течение 1 мин при 4 °C. Промойте боковые стенки надосадочной жидкостью, прежде чем вернуть шарики на хранение в холодильник.
4. Добавьте предварительно промытые шарики pY в раствор ресуспендированного образца в криопробирках с завинчивающейся крышкой. Инкубируйте их при температуре 4 °C на концевом ротаторе в течение ночи.
5. Поместите криопробирки с завинчивающейся крышкой в центрифужную пробирку объемом 50 мл, выстланную деликатной салфеткой. Крутите бусины при 100 x g в течение 1 минуты. Сохраните надосадочную жидкость, которая будет использоваться для обогащения пептидами pST.
6. Восстановите суспензию шариков с 300 μL буфера для связывания IP. Переложите их в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл и вращайте при 100 x g в течение 1 минуты при 4 °C.
7. Промойте инкубационную пробирку 3 раза 200 μл буфера для связывания IP. Каждый раз перекладывайте содержимое в одну и ту же микроцентрифужную пробирку. Затем поверните их вниз.
8. Промойте шарики в микроцентрифужной пробирке 3 раза с 500 μл буфера для связывания IP и уменьшите их при 100 x g в течение 1 минуты. Затем промойте шарики 4 раза 450 μл 25 мМ NH₄HCO₃, pH 7,5 и уменьшите их при 100 x g в течение 1 минуты. Каждый раз используйте свежий 25 mM NH₄HCO₃ раствор из порошка.
9. Центрифугируйте шарики при давлении 1 500 x g в течение 1 мин. Используйте гелезагрузочный наконечник, чтобы полностью удалить надосадочную жидкость, опустив кончик гелеобразного наконечника немного ниже поверхности шариков.
10. Добавьте в гранулы в 4 раза больше объема шариков 0,1% TFA (т.е. добавьте 300 μL 0,1% TFA для получения 75 μг суспензии pY гранул). Хорошо перемешайте их и инкубируйте смесь в термомиксере при 1 000 об/мин в течение 15 минут при 37 °C.
11. Перенесите ресуспендию в спиновой фильтр 0,2 мкм. Быстро раскрутите элюирующую трубку и передайте остаточный объем на тот же спиновой фильтр с помощью пипетки P10. Уменьшите скорость вращения фильтра при 850 x g в течение 1 минуты. Перенесите элюирование в микроцентрифужную пробирку с низким связыванием белка. Вакуумный концентрат элюата до сухости в течение ночи при температуре 40 °C и времени нагрева 300 мин.<бр/> заметка: Здесь эксперимент можно поставить на паузу. Заморозьте образцы при температуре -80 °C и продолжите в более поздние сроки.

Таблица 1: Буферы и решения.В этой таблице приведены составы буферов и растворов, используемых в данном протоколе.

буфер	том	состав
6 М буфер для лизиса хлорида гуанидиния	50 мл	6 М гуанидиния хлорид, 100 мМ трис pH 8,5, 10 мМ трис (2-карбоксиэтил) фосфин, 40 мМ хлорацетамида, 2 мМ ортованадата натрия, 2,5 мМ пирофосфата натрия, 1 мМ β-глицерофосфата, 500 мг н-октилгликозида, сверхчистая вода к объему
100 мМ пирофосфата натрия	50 мл	2,23 г декагидрата пирофосфата натрия, ультрачистая вода по объему
1М β-глицерофосфат	50 мл	15,31 г β-глицерофосфата, сверхчистая вода по объему
5% трифторуксусной кислоты	20 мл	Добавьте 1 мл 100% трифторуксусной кислоты в 19 мл ультрачистой воды
0,1% трифторуксусной кислоты	250 мл	Добавьте 5 мл 5% трифторуксусной кислоты в 245 мл сверхчистой воды
Элюирующий буфер pY	250 мл	0,1% трифторуксусная кислота, 40% ацетонитрил, сверхчистая вода по объему
Буфер элюирования pST	250 мл	0,1% трифторуксусная кислота, 50% ацетонитрил, сверхчистая вода к объему
Буфер привязки IP	200 мл	50 мМ с pH 7,4, 50 мМ хлорида натрия, сверхчистая вода по объему
25 мМ бикарбонат аммония, pH 7,5	10 мл	Растворить 19,7 мг в 10 мл стерильной ультрачистой воды, pH до 7,5 с 1 Н соляной кислотой (~10-15 μл/10 мл раствора), сделать свежим
1М фосфатный буфер, pH 7	1 000 мл	423 мл 1 М натрия дигидрофосфата, 577 мл 1 М натрия гидрофосфата
Буфер равновесия	14 мл	6,3 мл ацетонитрила, 280 мкл 5% трифторуксусной кислоты, 1740 мкл молочной кислоты, 5,68 мл ультрачистой воды
Буфер для промывки	20 мл	9 мл ацетонитрила, 400 мкл 5% трифторуксусной кислоты, 10,6 мл ультрачистой воды
Решение для масс-спектрометрии	10 мл	500 мкл ацетонитрила, 200 мкл 5% трифторуксусной кислоты, 9,3 мл сверхчистой воды
Буфер А	250 мл	5 мМ монокалийфосфата (pH 2,65), 30% ацетонитрила, 5 мМ хлорида калия, сверхчистая вода к объему
Буфер B	250 мл	5 мМ монокалийфосфата (pH 2,65), 30% ацетонитрила, 350 мМ хлорида калия, сверхчистая вода к объему
0,9% гидроксид аммония	10 мл	300 мкл 29,42% гидроксида аммония, 9,7 мл сверхчистой воды

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Лиофилизатор	Лабконко	7420020
Настольный вакуумный концентратор CentriVap	Лабконко	7810010
Кимвайпс	Научный центр Фишера	06-666А
Многопоровый спиновой фильтр 0,2 мкм	Миллипора Сигма	UFC30GVNB
Трубки Эппендорфа с низким связыванием белков	Эппендорф	22431081
антифосфотирозин, агароза, клон: 4G10	Миллипора Сигма	16101
Антитела к 27B10.4	Цитоскелет	Бусины APY03
Набор для пептидных анализов	Термо Сайентиал	No 23275
ТопСовет	Компания PolyLC Inc	TT200TIO.96
Колонны SCX (полисульфоэтил А)	Компания PolyLC Inc	SPESE1203
Шприц объемом 3 мл	БД	309657
Вода MilliQ			Деионизированная вода, используемая для приготовления всех растворов и буферов
Трифторуксусная кислота (ТЖК)	Научный центр Фишера	ПИ-28904
Ацетонитрил (АКЦ)	Научный центр Фишера	А21-1
Хлористый калий	Научный центр Фишера	БП366-500
молочная кислота	Сигма-Олдрич	69785-250МЛ
Гидроксид аммония	Научный центр Фишера	А669С-500
База Трис	Научный центр Фишера	БП152-5