Обогащение фосфопептидов на основе диоксида титана: метод селективного выделения фосфопептидов из пептидной библиотеки

Abstract

Источник: Cheng, L. C. et al. Обогащение фосфопептидом в сочетании с безметочной количественной масс-спектрометрией для исследования фосфопротеома при раке предстательной железы. J. Vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует обогащение фосфопептидов на основе диоксида титана, извлеченных из ткани опухоли предстательной железы. Эти обогащенные фосфопептиды могут быть использованы для последующих применений, таких как определение характеристик белков, чтобы понять клеточные сигнальные пути, участвующие в прогрессировании рака предстательной железы.

Protocol

1. Обогащение диоксидом титана pY пептидами

1. Ресуспендируйте высушенные фосфопептиды в 200 мкл 50% ACN, 0,1% TFA. Сделайте вихревую обработку и центрифугируйте их при давлении 10 000 x g в течение 30 с. Повторите это 1 раз, чтобы хорошо их восстановить.
2. Подготовка шариков TiO₂ содержится в типсах, которые имеют емкость для образцов объемом 200 мкл.
   1. Осторожно постучите по небольшой стороне кончика, чтобы переместить материал к этому концу. Промойте наконечник, добавив 200 μL 100% ACN, затем переверните наконечник и поверните маленький конец, чтобы переместить жидкость к колпачку.
   2. С помощью лезвия бритвы отрежьте маленький конец кончика и поместите его на трубку с низким уровнем связывания белка. (Избегайте использования полистирольных трубок, так как TiO₂ будет прилипать к стенкам трубки.) Снимите колпачок и вставьте микропипетку, чтобы вытащить оставшуюся АКЦ. Повторите стирку с 200 μл 100% ACN. Теперь шарики TiO₂ расположены в пробирке с низким уровнем связывания белка для следующих этапов.
   3. Предварительно подготовьте TiO₂ с 500 мкл 100% ACN 2x. Пипетируйте его, чтобы смешать шарики с растворителем. Центрифугируйте их при 100 х г в течение 1 минуты.
   4. Кондиционируйте TiO₂ 500 μл 0,2 М буфера фосфата натрия (pH ~7) 2x. Промойте шарики 300 μL уравновешивающего буфера 3x. Поскольку TiO₂ очень плотный, бусины будут быстро оседать.
3. Добавьте 400 мкл 50% ACN, 0,1% TFA в пробирку с низким уровнем связывания белка, а затем добавьте 84 мкл молочной кислоты. Перенесите ресуспендированные фосфопептиды в трубку с низким уровнем связывания белков и инкубируйте их в течение 1 ч при комнатной температуре с помощью вращателя «конец за концом».
4. Центрифугируйте шарики при 100 х г в течение 1 минуты, чтобы гранулировать их. Промойте их 300 мкл уравновешивающего буфера (Таблица 1) 2 раза и уменьшите до 100 x g в течение 1 минуты.
5. Промойте шарики 300 μL промывочного буфера 2x. Переложите их в фильтр 0,2 μm. Вращайте их со скоростью 1 500 x g в течение 1 минуты.
6. Перенесите фильтрующий блок в чистую пробирку объемом 1,5 мл с низким уровнем связывания белка. Разбавьте содержимое 200 мкл 0,9% NH₃ в H₂O. Измерьте pH с помощью полосок pH, который должен быть от 10 до 11. Вакуумный концентрат элюата высушить в течение ночи, чтобы выпарить аммиак.

Таблица 1: Буферы и растворы.В этой таблице приведены составы буферов и растворов, используемых в данном протоколе.

буфер	том	состав
6 М буфер для лизиса хлорида гуанидиния	50 мл	6 М гуанидиния хлорид, 100 мМ трис pH 8,5, 10 мМ трис (2-карбоксиэтил) фосфин, 40 мМ хлорацетамида, 2 мМ ортованадата натрия, 2,5 мМ пирофосфата натрия, 1 мМ β-глицерофосфата, 500 мг н-октилгликозида, сверхчистая вода к объему
100 мМ пирофосфата натрия	50 мл	2,23 г декагидрата пирофосфата натрия, ультрачистая вода по объему
1М β-глицерофосфат	50 мл	15,31 г β-глицерофосфата, сверхчистая вода по объему
5% трифторуксусная кислота	20 мл	Добавьте 1 мл 100% трифторуксусной кислоты в 19 мл ультрачистой воды
0,1% трифторуксусной кислоты	250 мл	Добавьте 5 мл 5% трифторуксусной кислоты в 245 мл сверхчистой воды
Элюирующий буфер pY	250 мл	0,1% трифторуксусная кислота, 40% ацетонитрил, сверхчистая вода по объему
Буфер элюирования pST	250 мл	0,1% трифторуксусная кислота, 50% ацетонитрил, сверхчистая вода по объему
Буфер привязки IP	200 мл	50 мМ с pH 7,4, 50 мМ хлорида натрия, сверхчистая вода по объему
25 мМ бикарбонат аммония, pH 7,5	10 мл	Растворить 19,7 мг в 10 мл стерильной ультрачистой воды, pH до 7,5 с 1 Н соляной кислотой (~10-15 μл/10 мл раствора), сделать свежим
1М фосфатный буфер, pH 7	1 000 мл	423 мл 1 М натрия дигидрофосфата, 577 мл 1 М натрия гидрофосфата
Буфер равновесия	14 мл	6,3 мл ацетонитрила, 280 мкл 5% трифторуксусной кислоты, 1740 мкл молочной кислоты, 5,68 мл ультрачистой воды
Буфер для промывки	20 мл	9 мл ацетонитрила, 400 мкл 5% трифторуксусной кислоты, 10,6 мл ультрачистой воды
Решение для масс-спектрометрии	10 мл	500 мкл ацетонитрила, 200 мкл 5% трифторуксусной кислоты, 9,3 мл сверхчистой воды
Буфер А	250 мл	5 мМ монокалийфосфата (pH 2,65), 30% ацетонитрила, 5 мМ хлорида калия, сверхчистая вода к объему
Буфер B	250 мл	5 мМ монокалийфосфата (pH 2,65), 30% ацетонитрила, 350 мМ хлорида калия, сверхчистая вода к объему
0,9% гидроксид аммония	10 мл	300 мкл 29,42% гидроксида аммония, 9,7 мл сверхчистой воды

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Вакуумный коллектор	Рестек	No 26080
Лиофилизатор	Лабконко	7420020
Настольный вакуумный концентратор CentriVap	Лабконко	7810010
Торцевой ротатор	ThermoFisher Scientific	415110Q
лезвие	Научный центр Фишера	620177
Центробежные фильтрующие установки Amicon Ultra-15	Миллипора Сигма	UFC901024
Nunc 15 мл конические пробирки	ThermoFisher Scientific	Тел.: 12-565-268
Многопоровый спиновой фильтр 0,2 мкм	Миллипора Сигма	UFC30GVNB
Трубки Эппендорфа с низким связыванием белков	Эппендорф	22431081
антифосфотирозин, агароза, клон: 4G10	Миллипора Сигма	16101
Набор для пептидных анализов	Термо Сайентиал	No 23275
Трифторуксусная кислота (ТЖК)	Научный центр Фишера	ПИ-28904
Ацетонитрил (АКЦ)	Научный центр Фишера	А21-1
молочная кислота	Сигма-Олдрич	69785-250МЛ
Гидроксид аммония	Научный центр Фишера	А669С-500
Фосфат калия одноосновной	Научный центр Фишера	БП362-500
Хлористый калий	Научный центр Фишера	БП366-500
Дигидрат хлорида кальция	Научный центр Фишера	БП510-500
База Трис	Научный центр Фишера	БП152-5
Монотип	Компания PolyLC Inc	TT200TIO.96