Моделирование рака предстательной железы на генетически модифицированных моделях мышей: CRISPR/Cas9-опосредованная техника локализованного редактирования генов в клетках передней доли предстательной железы мыши

Abstract

Источник: Riedel, M. et al. Вирус Доставка CRISPR направляет в предстательную железу мыши для изменения генов. J. Vis. Exp. (2018)

Это видео описывает метод редактирования определенных генов в клетках предстательной железы с использованием системы доставки на основе аденовируса. Этот подход позволяет проводить ортотопические и локализованные изменения экспрессии генов с использованием технологии CRISPR для разработки новых мышиных моделей рака предстательной железы.

Protocol

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Доставка вируса в предстательную железу мышей

1. Обезболивайте животное путем внутрибрюшинной инъекции с помощью стерильного шприца объемом 1 мл и иглы 27G x 1/2". Используйте анестезиологическую дозу 0,01 мл/г массы тела. Если процедура длится дольше 30 минут, поддерживайте анестезию, вводя 1/3 от начальной дозы каждые 30 минут.
2. Исследуйте глубину анестезии, оценивая мышечную релаксацию, отвод педалей и глазные рефлексы. Когда наблюдается потеря рефлексов, следует побрить нижнюю часть живота животного.
3. Тщательно прикройте глаза животного ветеринарной офтальмологической мазью с использованием стерильного ватного тампона, чтобы предотвратить слепоту из-за отсутствия роговичного рефлекса.
4. Протрите выбритый живот 70% этанолом и 10% повидон-йодом, чтобы продезинфицировать операционную область. Потрите операционную область от центра операционной области к периферии.
5. Выполните вертикальный разрез кожи по средней линии живота примерно 1 см с помощью стерильных хирургических ножниц.
6. Подтяните брюшину с помощью тонконаправленных щипцов, чтобы не повредить органы, лежащие под ней. Осторожно сделайте разрез <8 мм хирургическими ножницами через брюшину.
   Примечание: В отличие от человека, предстательная железа грызуна состоит из четырех отдельных долей. Передняя доля прикрепляется к семенному пузырьку.
7. Осторожно отодвиньте жировую ткань в сторону, чтобы обнажить семенной пузырь. С помощью кольцевых щипцов осторожно приподнимайте семенные пузырьки до тех пор, пока не будет идентифицирована передняя предстательная железа (Рисунок 1).
8. Введите раствор вируса в общем объеме 30 мкл (3 вирусные частицы по 10¹⁰) в передний эпителий предстательной железы с помощью инсулинового шприца объемом 0,5 мл с иглой 30G x 8 мм. Сведите к минимуму утечку и убедитесь, что жидкость впитывается в ткани, образуя небольшой пузырь. Поместите семенной пузырь обратно в брюшную полость.
9. Сшить брюшину 2-3 простыми прерывистыми швами с использованием 6-0 рассасывающихся нитей с кругом 13 мм, 3/8 и иглой с коническим концом.
10. Скрепите кожу тремя стерильными зажимами размером 4,8 x 6,5 мм, приподнимая кожу щипцами, чтобы не повредить брюшину.
11. Для лучшего восстановления применяют антидот для анестезии в дозе 0,01 мл/г массы тела путем внутрибрюшинного введения с помощью стерильного шприца объемом 1 мл и иглы 27 г x 1/2". Осторожно поместите животное обратно в клетку.

Results

Рисунок 1: Иллюстрация процедуры. Процедура проводится на мыши Rosa26-LSL-Cas9-EGFP, созданной Platt et al. Передняя предстательная железа (ПД) прикрепляется к семенному пузырьку (СВ). Вирусные частицы, экспрессирующие направляющую РНК и белок Cre, вводятся в переднюю предстательную железу для изменения экспрессии генов.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-cas9*,-} ^{EGFP)Fezh} /J мыши	Лаборатория Джексона	No 26175
0,5 мл инсулиновый шприц U-100	БД	324825	для инъекции вируса
1 мл шприц	БД	300013	для инъекций анестезии
Игла 30 г 1/2 дюйма	БД	304000 (Английский	для инъекций анестезии
6-0 Полисорб Шовный материал	Медтроник	ГЛ889	для закрытия брюшины
Одноразовая стерилизованная операционная простыня	Несколько поставщиков
Грелку	Несколько поставщиков
Повидон-йод Преп Прокладка	Научный центр Фишера	Тел.: 06-669-70
обрезной станок	Эскулап	ГТ415	для бритья живота
Щипцы Dumont	Ф.С.Т	11252-00
Микроиглодержатель Halsey Micro	Ф.С.Т	12500-12
Ножницы с радужной оболочкой	Ф.С.Т	14094-11
Узкие щипцы	Ф.С.Т	11002-12
Кольцевые щипцы	Ф.С.Т	11106-09
Ручка системы зажимов для ран вкл. Клипы	Ф.С.Т	12030-01	для закрытия кожи
Система удаления зажимов для ран	Ф.С.Т	12030-04
1x PBS	Gibco	10010-023
Антиседан			получено из животноводческого хозяйства
Буторфанол			получено из животноводческого хозяйства
Медетомидингидрохлорид			получено из животноводческого хозяйства
Мидазолам			получено из животноводческого хозяйства
100% этанол	Научный центр Фишера	22-032-103 (Английский
Глазная мазь	Такеда	7242
Вирусы (AAV, AV)	Несколько поставщиков		Вирус, используемый в этом протоколе, является собственным производством