$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Обработка бисульфитами
- В качестве образца используйте 45 мкл переваренного тканевого раствора.
- Обработку бисульфитом выполняют с использованием реагентов из набора для конверсии бисульфита в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
- Добавьте 5 мкл разбавляющего буфера в образец ДНК и инкубируйте при 37 °C в течение 15 мин (см. Таблицу материалов).
- Во время инкубации образцов приготовьте бисульфитный конверсионный реагент, добавив 750 мкл dH2O и 210 мкл разбавляющего буфера в одну пробирку конверсионного реагента CT (см. Таблицу материалов). Перемешайте пробирки путем вортекса в течение 10 минут.
- После 15-минутной инкубации добавьте 100 мкл приготовленного реагента для конверсии КТ в каждый образец и перемешайте методом инверсии.
- Инкубируйте образцы в темноте при температуре 50 °C в течение 12–16 часов.
- После инкубации извлеките образцы и поместите их на лед на 10 минут.
- Добавьте 400 мкл связующего буфера и перемешайте каждый образец, пипетируя вверх и вниз (см. Таблицу материалов). Загрузите каждый образец в спиновую колонку и поместите колонку в пробирку для сбора объемом 2 мл (см. Таблицу материалов).
- Центрифугируйте каждый образец на полной скорости (10 000 x g) в течение 1 минуты и отбросьте проточный поток.
- Добавьте 200 μL промывочного буфера в каждую колонну и вращайте на полной скорости в течение 1 минуты, отбрасывая проточный поток (см. Таблицу материалов).
- Добавьте 200 μл буфера для десульфирования в каждую колонну и дайте колонке постоять при комнатной температуре в течение 15 минут (см. Таблицу материалов). После инкубации вращайте колонны на полной скорости в течение 1 минуты и выбросьте проточный.
- Добавьте 200 μL промывочного буфера в каждую колонку и вращайте на полной скорости в течение 1 минуты (см. Таблицу материалов).
- Повторите этот шаг еще раз.
- Добавьте 46 мкл dH2O в каждую колонку и поместите каждую колонку в новую стерильную одноразовую полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл (см. Таблицу материалов). Вращайте каждую пробирку в течение 2 минут, чтобы получить ДНК.
- Снимите каждую спиновую колонку с одноразовой полипропиленовой трубки и выбросьте (см. Таблицу материалов). Теперь ДНК готова к анализу.
2. Количественная метилирование-специфическая ПЦР (qMSP)
- Используйте модифицированную бисульфитом ДНК из этапа 1.3 в качестве матрицы для флуоресцентной ПЦР в реальном времени в qMSP для оценки метилирования промоторной области в каждом анализе гена.
- Выполните qMSP с помощью 96-луночного прибора для ПЦР в реальном времени (см. Таблицу материалов).
- Проверьте статус метилирования промотора гена-мишени на бисульфит-модифицированной ДНК с использованием прямого праймера 200 нМ, обратного праймера 200 нМ и зондов 80 нМ. Приготовьте мастер-смесь с 16,6 мМ (NH4)2SO4, 67 мМ Tris pH 8,8, 10 мМ β-меркаптоэтанола, 10 нМ флуоресцеина, 0,166 мМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата и 0,04 Ед/л ДНК-полимеразы (см. Таблицу материалов). Конечный реакционный объем в каждой лунке для всех анализов составляет 25 мкл.
- Выполните циклическое выполнение qMSP следующим образом: 95 °C в течение 5 минут, затем 55 циклов при 95 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 1 минуты и 72 °C в течение 1 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ген-мишень должен быть выбран на основе критериев наличия больших бета-значений, принадлежности к островкам CpG в промоторной области и пригодности для разработки праймера и зонда для qMSP.
- Используйте человеческий геном, обработанный метилазой CpG (M.SssI) в качестве положительного контроля метилирования (см. Таблицу материалов).
заметка: Окончательная количественная оценка метилирования определяется как относительное значение метилирования (RMV) и рассчитывается как 2–ΔΔCt для каждой реплики обнаружения метилирования по сравнению со средним значением Ct для β-актина (ACTB). Последовательности праймеров и зондов приведены в таблице 1. Ct, равный 100, используется для необнаруженных реплик, что дает значение 2–ΔΔCt, близкое к нулю. Используется следующая формула:
среднее значение 2–ΔΔCt (RMV) = (2–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2–ΔΔ Ct_replicate_3)/3.
C
| ген | Вперед 5' - 3' | Задний ход 5' - 3' | зонд |
| В-АКТИН | TAG GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT | AAC ACA CAA TAA CAA ACA ATT CAC | \56-FAM\ TGT GGG GTG GTG \ZEN\ GTG ATG GAG GAG GTT TAG \3IABkFQ\ |
| EPB41L3 | GGG ATA GTG GGG TTG ACG C | АТА ААА АТК CCG ACG AAC GA | AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A |