Криоконсервация на основе витрификации: метод сверхбыстрого охлаждения для сохранения биологических образцов при очень низких температурах для долгосрочного хранения

Аннотация

Источник: Lu, J. H. et al. Создание моделей ксенотрансплантатов, полученных от пациентов с раком желудка, и первичных клеточных линий. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео мы демонстрируем метод сверхбыстрой криовитрификации для сохранения биологических образцов. Метод предполагает использование комбинации криопротекторов для защиты биологической ткани от замораживания за счет предотвращения внутриклеточного образования кристаллов льда.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Криоконсервация тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть в первую очередь относится к методам для Live Tissue Kit Cryo Kit. Основные комплекты и оборудование указаны в Таблице материалов.

1. Усыпляйте мышей с помощью метода, одобренного IRB, когда опухоль превышает 10 мм в диаметре.
2. С помощью стерильных щипцов и ножниц медленно изолируйте опухоль от мышей.
3. Промойте опухолевые ткани с помощью DPBS в посуде 10 см. Рассекайте и удаляйте некротические участки, жировую ткань, сгустки крови и соединительную ткань с помощью щипцов и ножниц.
4. Разрежьте ткани опухоли максимум до толщины 1 мм с помощью формы.
5. Вымойте ломтики с помощью DPBS в посуде диаметром 10 см.
   заметка: Процесс витрификации включает использование пробирок с маркировкой V1/V2/V3 на этапах 1.6-1.8. Основными ингредиентами являются ДМСО и сахароза.
6. Переложите ломтики в пробирку V1 с помощью щипцов и инкубируйте пробирку при температуре 4 °C в течение 4 мин. Сверните и быстро переверните пробирку и поместите ее при температуре 4 °C еще на 4 мин.
7. Вылейте раствор V1 и ломтики в посуду диаметром 10 см. Переложите срезы в пробирку V2 с помощью щипцов и инкубируйте пробирку V2 при температуре 4 °C в течение 4 минут. Сверните и быстро переверните трубку и поместите ее при температуре 4 °C еще на 4 минуты.
8. Налейте раствор V2 и ломтики в посуду диаметром 10 см. Переложите срезы в пробирку V3 с помощью щипцов и инкубируйте пробирку при температуре 4 °C в течение 5 минут. Сверните и быстро переверните трубку и поместите ее при температуре 4 °C не менее чем на 5 минут. Убедитесь, что все ломтики опустились на дно трубки.
   1. Если несколько ломтиков остаются плавающими, сверните и коротко переверните трубку, а затем снова поместите трубку при температуре 4 °C, пока все ломтики полностью не утонут; при необходимости выбросьте плавающие ломтики.
9. Налейте раствор V3 и ломтики в посуду диаметром 10 см.
10. Разрежьте держатели для салфеток до нужной длины и поместите их на стерильную марлю. Переложите ломтики на держатели. Оберните держатели марлей и поместите их в жидкий азот с помощью щипцов с последующей инкубацией в течение 5 минут.
11. Наклейте на криогенные флаконы информацию о ткани.
12. Переложите держатели с тканевыми срезами в криогенные флаконы, которые хранят в жидком азоте.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Набор для живых тканей Cryo Kit	Celliver Biotechnology, Шанхай, Китай	ЛТ2601
Пресс-формы и вспомогательные лезвия с тканевой обработкой	Celliver Biotechnology, Шанхай, Китай	ЛТ2603
ДПБС	Basalmedia Technology, Шанхай, Китай	Л40601