Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были проверены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Изоляция LDN от лаважей брюшной полости
- Получение образцов
- Вводите 1000 мл нормального стерильного физиологического раствора непосредственно в брюшную полость перед закрытием раны пациентам, перенесшим абдоминальную операцию из-за злокачественных новообразований желудочно-кишечного тракта.
заметка: Образцы были получены от пациентов, перенесших гастрэктомию, колэктомию или эзофагэктомию без предвзятости по возрасту или полу. Физраствор перекладывали в емкость и заливали на всю брюшную полость в течение одной минуты. Это рутинно выполняется в виде послеоперационного промывания брюшины без существенных последствий для пациентов.
- Обширное промывание брюшной полости в течение не менее 1 мин.<бр/>
заметка: Рекомендуется медленно помешивать введенную жидкость руками хирурга, чтобы образцы были однородными.
- Восстановите 200 мл жидкости для промывания с помощью четырех шприцев по 50 мл.
заметка: Иногда для сбора жидкости используется резиновый соединитель .
- Выполнение очистки перитонеального LDN с использованием гранулоцитарного специфичного mAb, CD66b
заметка: Поскольку промежуточный слой после центрифугирования с градиентом плотности содержит много мононуклеарных клеток, был проведен положительный отбор полиморфных нейтрофилов с использованием CD66b mAb.
- Переложите жидкость для перитонеального лаважа в пробирку объемом 50 мл.
заметка: На этом этапе пропустите жидкости через нейлоновый фильтр толщиной 100 мкм, чтобы удалить загрязнения.
- Центрифугируйте перитонеальную жидкость при 270 x g в течение 7 мин при RT.
- Ресуспендируйте гранулы в 5 мл PBS с 0,02% ЭДТА.
- Осторожно наложите 5 мл клеточной суспензии на раствор градиента плотности 3 мл.
- Центрифугируйте при давлении 1 700 x g в течение 15 мин при RT без перерывов.
- Соберите около 2–3 мл раствора, содержащего промежуточные слои (рис. 1A), с помощью пипетки и смешайте его с 10 мл PBS с 0,02% ЭДТА.
- Центрифугируйте перитонеальную жидкость при давлении 400 x g в течение 7 минут при RT и выбросьте надосадочную жидкость.
- Добавьте еще 10 мл PBS с 0,02% ЭДТА и центрифугируйте при 270 x g в течение 7 минут при RT. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Растворите гранулу ячейки (1 x 107) в 60 мкл буфера для набора для разделения магнитных элементов.
- Добавьте в гранулы 20 μL блока Fc и инкубируйте в течение 10 минут при 4 °C.
- Добавьте 20 мкл анти-CD66b, конъюгированного с микрогранулами, и инкубируйте еще 10 мин при 4 °C.
- Промойте и повторно суспендируйте гранулы в 500 мкл буфера MACS.
- Нанесите суспензию ячеек на магнитную колонку в магнитном поле подходящего магнитного сепаратора и соберите проточные ячейки, содержащие CD66b(-), промыв колонку 15 мл буфера.
- Извлеките колонку из магнитного сепаратора и немедленно промойте ячейки CD66b(+) с магнитной маркировкой, с усилием вставив поршень в колонку.
заметка: Популяция клеток CD66b(+) состоит в основном из нейтрофилов, что определено с помощью анализа FACS, что указывает на то, что >95% фракции CD66(+) положительны на CD11b, CD15 и CD16, но отрицательны на CD14.
