Флуоресцентная микроскопия внеклеточных ловушек нейтрофилов или НВЛ: метод наблюдения адгезивного взаимодействия между раковыми клетками и НВЛ

Аннотация

Источник: Kanamaru, R. et al. Внеклеточные ловушки нейтрофилов, генерируемые нейтрофилами низкой плотности, полученными из жидкости перитонеального лаважа, опосредуют рост и прикрепление опухолевых клеток. J. Vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует флуоресцентное окрашивание внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ), компонентов внеклеточной ДНК, выбрасываемых нейтрофилами. Этот метод позволяет визуализировать адгезивное взаимодействие между раковыми клетками и НВЛ.

Протокол

1. Окрашивание опухолевых клеток красным флуоресцентным клеточным линкером

1. Получите линии раковых клеток человека MKN45, NUGC и OCUM-1.
2. Промыть 1 x 10⁷ клеток PBS + 0,02% ЭДТА в пробирке объемом 15 мл и центрифугировать при 270 x g в течение 7 минут при RT.
3. Добавьте 1 мл раствора для окрашивания красителя в гранулы и аккуратно пипеткой.
4. Растворите 4 мкл красителя Red Fluorescent Cell Linker в 1 мл раствора для окрашивания и смешайте с клеточной суспензией, начиная с шага 1.2.
5. Инкубируйте гранулы в течение 4 минут при RT.
6. Добавьте 4 мл DMEM (10% FBS), чтобы остановить реакцию окрашивания.
7. Центрифугируйте 270 x g в течение 7 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
8. Повторите шаги 1.6 и 1.7 дважды.
9. Проверьте с помощью флуоресцентного микроскопа (возбуждение = 551 нм, излучение = 567 нм), что опухолевые клетки окрашены в красный цвет.

2. Анализ адгезии опухолевых клеток к НЭО

1. Культивирование нейтрофильных клеток низкой плотности в 6-луночной пластине, покрытой поли-L-лизином (диаметром 6 см) в течение 2 ч при 37 °C в 5%_CO2, что позволяет производить нейтрофильные внеклеточные ловушки или НВЛ
2. Перенесите красные флуоресцентные окрашенные опухолевые клетки (1 x 10⁶) в 1 мл RPMI 1640 с добавлением 0,1% BSA.
3. Добавьте опухолевые клетки к культуре LDN, которая продуцировала НВЛ.
4. Инкубировать в течение 5 минут при 37 °C, что позволяет опухолевым клеткам контактировать с НВЛ.
   заметка: Длительная инкубация индуцирует адгезию опухолевых клеток к LDN или к планшетам.
5. Удалите среду и аккуратно промойте лунки, добавив 2 мл предварительно подогретой среды (0,1% BSA + RPMI 1640) и переворачивая посуду.
6. Повторите процедуру стирки на шаге 2,5 дважды.<бр/> заметка: Поскольку НВЛ слабо прикрепляются к пластине, мытье следует производить как можно аккуратнее, чтобы избежать снятия самих НВЛ.
7. Добавьте зеленый флуоресцентный краситель для окрашивания ядра и хромосом в конечной концентрации 5 мкг/мл для визуализации НВЛ.
8. Наблюдайте за НВЛ и прикрепленными опухолевыми клетками с помощью соответствующих фильтров (зеленый, возбуждение = 504 нм, излучение = 523 нм; красный, возбуждение = 551 нм, излучение = 567 нм).
9. Объедините рисунки, чтобы показать опухолевые клетки, захваченные НВЛ.
   заметка: В некоторых экспериментах фермент деградации ДНК добавляли в культуру LDN (конечная концентрация 100 Ед/мл) за 5 мин до совместной инкубации в течение 5 мин.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
SYTOX зеленая нуклеиновая кислота краситель 5 мМ раствор в ДМСО	Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	С7020
PKH26 Красный набор флуоресцентных клеточных линкеров для общего мечения клеточных мембран	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	П9691
RPMI1640 Средний	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	Р8758
Лиофилизированный порошок альбумина бычьей сыворотки, ≥96% (электрофорез в агарозном геле)	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	А2153
МИКРОПЛАСТИНА 6Well с поли-L-лизиновым покрытием	ИВАКИ, Япония	4810-040
Флуоресцентный стереомикроскоп	BX8000, Кейенс, Осака, Япония	БЗ-Х710
MKN45 клеточная линия рака желудка человека	Рикен, Тукуба, Япония	Н/Д
NUGC-4 клеточная линия рака желудка человека	Рикен, Тукуба, Япония	Н/Д
Клеточная линия рака желудка человека OCUM-1	Городской университет Осаки, Япония	Н/Д	Подарок от доктора М. Ясиро
ДНКаза I	Уортингтон, Лейквуд, Нью-Джерси	LS002138
0,5 моль/л раствора ЭДТА (pH 8,0)	Накалаи теске, Япония	06894-14
Модифицированный Eagle Dulbecco's Medium-high glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	Д5796