Покадровая флуоресцентная микроскопия нейтрофильных внеклеточных ловушек или НВЛ: метод анализа постадгезионного взаимодействия между раковыми клетками и НВЛ

Аннотация

Источник: Kanamaru, R. et al. Внеклеточные ловушки нейтрофилов, генерируемые нейтрофилами низкой плотности, полученными из жидкости перитонеального лаважа, опосредуют рост и прикрепление опухолевых клеток. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы анализируем постадгезионное поведение раковых клеток, попавших в нейтрофильные внеклеточные ловушки (НЭО), путем совместного культивирования нейтрофилов низкой плотности и клеток рака желудка. Покадровый видеоанализ помогает отслеживать различные клеточные события и изучать роль НВЛ при патологических состояниях.

Протокол

1. Анализ замедленного видео захваченных опухолевых клеток

1. Культивируют перитонеальные LDN в круглой чашке диаметром 35 мм, покрытой поли-L-лизином, и инкубируют в течение 2 ч при 37 °C при 5%_CO2.
2. Добавьте зелено-флуоресцентный краситель для окрашивания ядра и хромосом для визуализации НВЛ при конечной концентрации 5 мкМ.
3. Через 1 минуту инкубации удалите среду и добавьте 2 мл 0,1% BSA + RPMI 1640.
4. Удалите фильтрующий материал и добавьте неокрашенные элементы 1 x 10⁶ MKN45, суспензированные в 0,1% BSA + RPMI 1640. Инкубировать в течение 5 минут при RT.
5. Удалите все неприкрепленные опухолевые клетки, аккуратно вымойте посуду, добавив 2 мл предварительно подогретой среды (0,1% BSA + RPMI 1640) и взболтав чашку.
6. Повторите вышеописанную процедуру стирки дважды.<бр/> заметка: Поскольку НВЛ слабо прикрепляются к пластине, мытье следует производить как можно аккуратнее, чтобы избежать снятия самих НВЛ.
7. Добавьте DMEM с 10% FCS с добавлением 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
8. Установите чашку для культивирования в систему наблюдения за клетками с полным обзором и выберите соответствующее поле, в котором опухолевые клетки захватываются НВЛ.
9. Продолжайте совместное культивирование в течение еще двух дней и делайте непрерывные фотографии поля каждые 6 минут при нормальном освещении и флуоресценции, которые обнаруживают клетки MKN45 и НВЛ соответственно.
10. Накладывайте изображения в каждой временной точке и создавайте покадровые видео с помощью программы Image Viewer.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
SYTOX зеленая нуклеиновая кислота краситель 5 мМ раствор в ДМСО	Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	С7020
RPMI1640 Средний	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	Р8758
Модифицированный Eagle Dulbecco's Medium-high glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	Д5796
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS)	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	Д8537
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, сертифицированные регионы, одобренные Министерством сельского хозяйства США	gibco от Life Technologies, Мексика	10437-028 (Английский)
Лиофилизированный порошок альбумина бычьей сыворотки, ≥96% (электрофорез в агарозном геле)	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	А2153
Пенициллин стрептомицин	Life Technologies Япония	15140-122
Плазмоцин профилактический	InvivoGen, Сан-Диего, Калифорния-США	АНТ-МПП
Флуоресцентный стереомикроскоп	BX8000, Кейенс, Осака, Япония	БЗ-Х710
Система наблюдения за ячейками полного обзора	Nikon, Канагава, Япония	Биостудия (BS-M10)
MKN45 клеточная линия рака желудка человека	Рикен, Тукуба, Япония	Н/Д