Подготовка экзосом: протокол сохранения экзосом из культивируемых клеток рака толстой кишки человека

Аннотация

Источник: Jung, M. K. et al. Подготовка образцов и визуализация экзосом с помощью просвечивающей электронной микроскопии. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео описывается техника приготовления блоков экзосом из культивируемых опухолевых клеток желудочно-кишечного тракта. Эти экзосомные блоки могут быть дополнительно срезаны, окрашены и визуализированы для определения положения конкретных белков в липидном бислое везикулы.

Протокол

1. Блочная подготовка экзосом

1. Гранулировать экзосомы из надосадочной жидкости культуры клеток HCT116 методом центрифугирования при 100 000 х г в течение 1,5 ч. Удалить надосадочную жидкость культуры и осторожно зафиксировать очищенную гранулу экзосомы 1 мл 2,5% глутаральдегида в 0,1 М растворе какодилата натрия (pH 7,0) в течение 1 ч при 4 °C. Для 0,1 М какодилата натрия, растворить 4,28 г какодиловой кислоты в 160 мл дистиллированной воды (DW). Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью 0,1 M HCl, затем добавьте до 200 мл дистиллированной воды.
2. Снимите фиксатор и промойте гранулы 1 мл 0,1 М буфера какодилата натрия при комнатной температуре. Повторите три раза, каждая смена длится 10 минут.
3. После этого зафиксируйте образец 1 мл 2% тетраоксида осмия на 1 ч при температуре 4 °C.
4. Снимите фиксатор и трижды промывайте 0,1 М буфером из какодилата натрия каждые 10 минут.
5. Инкубировать в течение 10 минут с помощью градуированного ацетонового ряда (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% соответственно) на шейкере.
6. Удалите ацетон и инкубируйте раствор смеси 3:1 ацетон:низкая вязкость в течение 30 минут. Гранула экзосомы находится в пробирке.
7. Удалите среду и добавьте среду 1:1 ацетон: смесь с низкой вязкостью, затем инкубируйте в течение 30 минут.
8. Удалите среду и добавьте среду 1:3 ацетон: смесь с низкой вязкостью, затем инкубируйте в течение 30 минут.
9. Удалите среду и добавьте смесь для заделки со 100% низкой вязкостью и выдерживайте в течение ночи при комнатной температуре.
10. Погрузите образец в чистую смесь для заделки с низкой вязкостью с помощью закладочной формы и выпекайте в течение 24 часов при 65 °C.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Глутаральдегид	ЭМС	16200
Какодилат натрия	ЭМС	12300
Тетраоксид осмия 1 г кристалл	ЭМС	19100	Использовать только в вытяжном шкафу
ацетон	ДЗЮНСЭЙ	1В2031

г.