Иммуноокрашивание экзосомальных срезов золотом: методика визуализации диагностических маркеров в экзосомальном просвете

Аннотация

Источник: Юнг, М. К., Мун, Д. Й. Подготовка образцов и визуализация экзосом с помощью просвечивающей электронной микроскопии. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы демонстрируем иммуноокрашивание золота биомаркеров, локализованных в просветной области ультратонких экзосомальных срезов. Этот метод позволяет проводить раннюю диагностику заболеваний путем визуализации молекул-мишеней в экзосомах, секретируемых больными клетками.

Протокол

1. Иммуноокрашивание секций экзосом и визуализация

1. С помощью ультрамикротома подготовить ультратонкие срезы экзосомного блока с длиной волны 60 нм и собрать их на никелевой сетке.
2. Инкубируйте решетки в каплях 0,02 М глицина по 50 мкл в течение 10 мин для гашения свободных альдегидных групп.
3. Промыть в 100 мкл DW три раза в течение 10 мин. Инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч в PBS, содержащем 1% BSA.
4. Инкубировать сетки в каплях анти-KRS по 50-100 мкл (1:100 в PBS, содержащем 0,1% BSA) в течение 1 ч (при необходимости этот этап следует проводить при 4 °C в течение ночи).
5. Промойте решетки пятью отдельными каплями (50 μл) PBS, содержащими 0,1% BSA, в течение 10 минут каждая.
6. Перенесите сетки в капли вторичного антитела на 1 ч (антикроличий IgG, конъюгированный с частицей золота с длиной волны 10 нм (1:100) в PBS, содержащем 0,1% BSA).
7. Промывайте решетки пятью отдельными каплями (50 μл) PBS, содержащими 0,1% BSA, каждые 10 минут.
8. Дважды окрашивать 2% уранилацетатом в течение 20 мин в темное время суток и цитратом свинца Рейнольдса в течение 10 мин соответственно.
9. Наблюдайте за сетками при просвечивающей электронной микроскопии при напряжении 80 кВ.
10. Нажмите «Получить», а затем нажмите «Файл» и «Сохранить как» в системе ПЗС-камер под ПЭМ на 80 кВ. Время экспозиции следует за автоматическими настройками.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Уранилацетат	ЭМС	No 22400	Опасное химическое вещество
Цитрат свинца	ЭМС	17900
Просвечивающая электронная микроскопия	Хитачи	Н7600
Медная сетка	ЭМС	Г200-Ку
глицин	сигма	022К5404
Фосфатный буферный раствор	сигма	П4417
Бычий сывороточный альбумин	Аурион	No 25557
Очищенное антитело к человеку CD274 (B7-H1, PD-L1)	Биолегенда	329710 (Английский	Целая гора Immumogold
Очищенная мышь IgG2b, κ изотип Ctrl	Биолегенда	401202	Крепление Immumogold целиком (Control)
2-й Антимышиный IgG конъюгированный с 9-11 нм частицей золота	сигма	Г7652
Параформальдегид	ЭМС	19210