$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Замораживание и наращивание мышц
- Погрузите нижнюю половину небольшого пластикового стакана (50 мл), содержащего изопентан, в жидкий азот. Изопентан готов к использованию, когда он становится слегка вязким и образует твердый белый ламинат, покрывающий внутреннюю часть стакана (температура: -160 °C).
заметка: Всегда используйте неискрящиеся бронзовые или алюминиевые ручные инструменты. Избегайте вдыхания паров продукта. Используйте при достаточной вентиляции. Если справиться с разливом и вентиляцией невозможно или нецелесообразно, наденьте подходящий респиратор.
- Заморозьте некоторое количество закладочной среды на патроне (пробке), кратковременно (10 секунд) погрузив его в изопентан.
- Обращайтесь с мышцей (например, большеберцовой или икроножной мышцей), удерживая ее за сухожилие, вертикально относительно пробки, чтобы сохранить ориентацию волокон и обеспечить поперечные сечения.
- Осторожно расположите конечную часть свежей мышцы поверх замороженной засадочной среды.
заметка: Мышца прилипнет. Важно НЕ полностью окружать мышцу внедряющей средой. Также важно сохранить вертикальную ориентацию для последующего определения площади поперечного сечения.
- Опустите патрон с прикрепленной мышцей в ванну с изопентаном (обычное время замораживания составляет 7-15 с, в зависимости от размера и состава образца).
заметка: Погружение в замораживающий раствор не должно длиться дольше, чем нужно для полной заморозки образца. Слишком долгое замораживание приведет к разрушению тканевого блока, в то время как слишком короткое время приведет к образованию кристаллов льда. Хорошо замороженный экземпляр будет мелового белого цвета.
- После заморозки образца поместите его в небольшой пластиковый пакет или пробирку для образцов (50 мл) и сразу же храните в глубокой морозильной камере при температуре -80 °C или в жидком азоте.
2. Секционирование мышц
- Установите рабочую температуру внутренней камеры криостата на отметке -23 °C.
- Дайте экземпляру (ранее хранившемуся при -80 °С) акклиматизироваться при рабочей температуре (пары часов должно хватить).
- Разрежьте несколько участков образца толщиной 8 мкм (предпочтительно переднюю большеберцовую или икроножную мышцы) и соберите их на предметных стеклах.
заметка: Разрежьте срез в средней части живота. Также, для точности, разрежьте срезы перпендикулярно оси крепления.
- Храните стеклянные предметные стекла внутри криостатной камеры. Не дайте им оттаять, если целью является проведение исследований IF/IHC или ферментативное окрашивание.
- Храните предметные стекла при температуре -80 °C для дальнейшего анализа.