Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Устройство
- Обработайте основную часть основания устройства из твердого блока ацетиловой смолы высокой плотности, как описано в данной рукописи. На каждом конце создайте приподнятые полосы диаметром 3 мм и вырежьте из этих канавок диаметром 2,5 мм станок, чтобы взять стержни (см. Рисунок 1 и Рисунок 2).
- Сделайте стержни из нержавеющей стали диаметром 2,4 мм с закругленными концами.
заметка:Основная рама крышки была выточена из дюралюминиевой пластины.
2. Использование устройства
- Рассеките тонкую кишку и толстую кишку из брюшной полости с помощью ножниц и пальцев в перчатках. Удалите брыжейку, удерживая ее изогнутыми щипцами и аккуратно оттягивая от кишечника.
- Промойте кишечник холодным фосфатно-солевым раствором (PBS, pH 7,4) с помощью наконечника пипетки типа Жильсона, который был обрезан на более широком конце так, чтобы его можно было поместить на пластиковый шприц объемом 10 или 20 мл люэра.
- Выложите тонкую кишку (SB) на лист бумажного полотенца и разделите на три равных по длине участка (проксимальную, среднюю и дистальную — SB1, SB2 и SB3) с помощью ножниц. Удалите слепую кишку и выложите двоеточную.
- Сделайте несколько очень маленьких надрезов в кишечных сегментах ножницами, чтобы жидкость вышла, и положите лист бумажного полотенца на кишечник и аккуратно проведите пальцем по препаратам, чтобы выдавить жидкость и промокнуться насухо.
- Поднимите секции и вставьте стержни из нержавеющей стали, которые ранее были смочены в стакане с фосфатно-соевым буфером.
заметка: Кишечник при желании может быть вывернут наизнанку (вывернут наизнанку).
- Наклейте этикетку на лист картона или фильтровальной бумаги, вырезанный по размеру, чтобы он поместился в основание устройства. Лучше всего подойдет карандаш, так как он не подвержен влиянию практически всех растворов. Предлагается дата вскрытия, экспериментальный код и идентификационный номер животного.
- Поместите карту или фильтровальную бумагу в основание устройства. Вставьте стержни и кишки в пазы в основании устройства. Убедитесь, что проксимальный конец сегментов расположен стандартизированным образом. Проксимальные концы должны находиться рядом с этикетками карты.
- Поместите верхнюю часть устройства над основанием. Используйте наклонные стержни для направления лезвия скальпеля для продольной резки секций.
заметка: Помогает, если ткань аккуратно и бережно удерживать пальцем, чтобы она не двигалась вместе с ножом.
- Снимите верхнюю часть устройства. Осторожно удалите фильтровальную бумагу и салфетки (все еще на их стержнях).
заметка: Кусок жесткой картона, помещенный под фильтровальную бумагу, поможет поднять.
- Слегка намочите (кончиком пальца в перчатке, смоченным в PBS) сегменты. Прокатывайте стержень из стороны в сторону, чтобы раскрыть кишку и развести ее горизонтально. После этого салфетка прилипнет к фильтровальной бумаге.
- Визуально осмотрите препараты на предмет любых грубых поражений.
- Перенесите салфетку, приклеенную к фильтровальной бумаге, в неглубокую ванну (или коробку для бутербродов), содержащую фиксатор.
заметка: После того как салфетка прилипнет к фильтровальной бумаге или к карте, она останется прочно прикрепленной. Для сохранения препарата можно использовать широкий спектр фиксаторов. Рекомендуется использовать жидкость Карноя для исследования пролиферации клеток кишечника, что является идеальной фиксацией для лучших методов пролиферации клеток; Тем не менее, формалин или многие другие фиксаторы также могут быть использованы, если требуются другие конечные точки.
- После фиксации (обычно через 3 ч) переведите препараты в 70% этанол. Затем образцы могут храниться до тех пор, пока они не понадобятся. Препараты могут быть изучены в натуральном отношении и/или использованы для подготовки гистологических образцов для H&E или других методов гистологического окрашивания, иммуногистохимии и/или гибридизации in situ.
заметка: Длительная фиксация может снизить иммуногистохимическую реактивность и/или реактивность гибридизации in situ. Полипропиленовые коробки для сэндвичей идеально подходят для хранения большого количества заготовок.
- При необходимости неподвижные ткани из различных сегментов кишечника могут быть изготовлены в «швейцарские рулеты» и окрашены с помощью всего спектра гистологических методов, в том числе описанных выше. Чтобы сделать «швейцарский рулет», кишечные сегменты отделяют от фильтровальной бумаги, обматывают коктейльной палочкой или зубочисткой, закрепляют энтомологическим штифтом и обрабатывают для заделки воском.
- При необходимости окрашивайте объемную ткань метиленовым синим для визуализации аберрантных очагов крипты.
- Запишите заданные заготовки на досуге.
