$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Приготовление растворов
- Как описано в таблице 1, приготовьте буфер для варочной кишки, разделительную среду на основе диоксида кремния 100%, среду для разделения плотности на основе диоксида кремния 66%, среду для разделения плотности на основе диоксида кремния 44%, буфер для разложения коллагеназы Е и буфер FACS.
- Приготовьте Colon Buffer за день до процедуры и храните в течение ночи при температуре 4 °C.
- Приготовьте разделительный материал на основе 100% диоксида кремния за день до процедуры и храните в течение ночи при температуре 4 °C, а утром в день процедуры поместите при комнатной температуре, чтобы он оттаял.
- Приготовьте разделительную среду на основе 66% и 44% диоксида кремния утром в день изоляции, используя разделительную среду на основе 100% диоксида кремния комнатной температуры и буфер для толстой кишки.
- Измерьте соответствующее количество коллагеназы Е, полученной из Clostridium histolyticum, и храните при температуре -20 °C в течение ночи перед процедурой. На следующее утро растворите в соответствующем объеме Colon Buffer, чтобы получить Collagenase Digestion Buffer. Для всех инкубаций с Коллагеназой Digestion Buffer в день процедуры предварительно подогрейте растворы до 37 °C.
- На всех этапах протокола одну центрифугу следует поддерживать при температуре 20 °C и частоте вращения 859 x g, при этом тормоза отключены (0 замедления) для градиентного центрифугирования. Установите другое значение на 4 °C и скорость вращения 859 x g со стандартным замедлением для ступеней стирки.
2. Забор толстой кишки
- Усыпьте мышь с помощью асфиксии CO2 с последующим подтверждением, одобренным AALAC.
- Поместите мышь в лежачее положение и сбрызните мех 70% этанолом. С помощью больших тканевых ножниц сделайте вертикальный разрез по средней линии и обнажите неповрежденную брюшину.
- С помощью ножниц для тонкого рассечения раскройте брюшину. С помощью щипцов сдвиньте тонкую кишку в одну сторону и обнажите нисходящую ободочную кишку. Слегка потяните вверх по нисходящей ободочной кишке, чтобы максимально обнажить ректальную часть толстой кишки. Разрежьте дистальный отдел прямой кишки глубоко в области таза и рассеките и удалите всю толстую кишку как единое целое, от дистального отдела прямой кишки до слепой кишки.
- Переложите толстую кишку в охлажденный буфер для толстой кишки объемом 20 мл в полипропиленовую пробирку объемом 50 мл.
3. Чистка двоеточия
- Положите толстую кишку на смоченное бумажное полотенце и удалите твердый стул, слегка надавливая на стенку кишечника тупым концом ножниц или щипцов.
- Поместите толстую кишку в чашку Петри и промойте кишечник 10 мл охлажденного буфера для толстой кишки с помощью шприца объемом 10 мл с тупой иглой для заполнения 18 г.
- Переложите толстую кишку на смоченное бумажное полотенце Colon Buffer и удалите брыжейку и жир острым концом ножниц.
- Поместите толстую кишку в чашку Петри, наполненную 5-10 мл охлажденного буфера для толстой кишки, перемешивая вручную, чтобы промыть оставшееся содержимое толстой кишки. Повторите 2-3 раза.
- Разрежьте толстую кишку в продольном направлении от более мускулистого ректального конца до проксимального отдела ободочной кишки (образуя одну прямоугольную открытую толстую кишку) в чашке Петри, наполненной свежим, охлажденным буфером для толстой кишки. Выбросьте существующий носитель и наполните его чистым охлажденным буфером для двоеточия.
- Промойте кишечник 3 раза, энергично взбалтывая его в чашке Петри и заменяя 5-10 мл охлажденного буфера для толстой кишки после каждого промывания.
- Положите прямоугольную ткань толстой кишки на бумажное полотенце, смоченное в Colon Buffer, и разрежьте ее, разрезав горизонтально, а затем на мелкие фрагменты (секции 3 мм x 3 мм).
- Осторожно соберите фрагменты толстой кишки с помощью тонких щипцов в охлажденный буфер для толстой кишки объемом 20 мл в полипропиленовой конической пробирке объемом 50 мл.
- Промойте фрагменты толстой кишки три раза, каждый раз в буфере для толстой кишки объемом 20 мл, энергично вращая трубку в течение 30 с. Между каждым перемешиванием дайте фрагментам ткани осесть на дно трубки. Сцеживайте или вакуумируйте надосадочную жидкость, предотвращая потерю фрагментов ткани в процессе аспирации между каждой промывкой.
заметка: Нет необходимости менять трубку после каждой стирки.
4. Расщепление коллагеназы 1
- Добавьте 20 мл буфера для расщепления коллагеназы к промытым фрагментам толстой кишки в полипропиленовой конической пробирке объемом 50 мл.
- Поместите закрытую пробирку объемом 50 мл при температуре 37 °C в инкубированный орбитальный шейкер со скоростью вращения 2 x g на 60 мин. Убедитесь, что фрагменты ткани находятся в постоянном движении во время перемешивания; при необходимости увеличивайте скорость вращения постепенно, чтобы гарантировать, что фрагменты ткани не оседают на дно пробирки.
5. Подготовка градиентов разделительной среды на основе диоксида кремния
- Приготовьте разделительную среду на основе 66% и 44% диоксида кремния, используя 100% плотносную разделительную среду на основе диоксида кремния при температуре 20 °C (комнатная температура) и буфер для толстой кишки.
- Налейте 5 мл 66% разделительной среды на основе диоксида кремния в каждую из 3 отдельных полипропиленовых пробирок объемом 15 мл. Подготовьте по три пробирки на толстую кишку. Это формирует базу с более высокой плотностью для процедуры градиентной изоляции, на которую будут наслаиваться разделительные среды с более низкой плотностью для создания градиента разделения.
- Хранить при температуре 20 °C до использования.
6. Сбор надосадочной жидкости из Digestion 1
- Соберите только надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки объемом 25 мл и отфильтруйте надосадочную жидкость через тканевое фильтрующее сетчатое фильтрующее фильтрующее отверстие 40 мкм, помещенное в чистую полипропиленовую коническую пробирку объемом 50 мл, после завершения расщепления коллагеназы 1. Будьте осторожны, чтобы не отсасывать существующие фрагменты тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните все оставшиеся видимые фрагменты ткани в трубке. Они будут подвергнуты второму расщеплению коллагеназы (шаг 8).
7. Гашение буфера для пищеварения коллагеназы
- Полностью заполните полипропиленовую пробирку объемом 50 мл охлажденным буфером для толстой кишки.
заметка: Коллагеназа активна при 37 °C; Следовательно, охлажденный буфер инактивирует этот фермент.
- Центрифугируйте пробирку при 4 °C при 800 x g в течение 5 минут.
- Выбросьте надосадочную жидкость с помощью вакуумной аспирации. Промойте ячейки 25 мл свежего буфера для толстой кишки и центрифугируйте при 800 x г в течение 5 минут.
- Повторно суспендируйте гранулу в менее чем 1 мл свежего, охлажденного буфера для толстой кишки.
- Положите полипропиленовую коническую трубку объемом 50 мл на лед.
8. Расщепление коллагеназы 2
- Повторите шаг 4 (Пищеварение 1) с оставшимися фрагментами ткани, оставшимися от шага 6.1.
9. Дезагрегация тканей после пищеварения 2
- Энергично промойте фрагменты ткани вперед и назад между трубкой и шприцем объемом 10 мл через иглу с тупым концом 18G.
- Повторяйте эту промывку в течение как минимум 7-8 полных проходов, продолжая до тех пор, пока не останутся видны грубые фрагменты тканей или мусор.
10. Фильтрующие ячейки
- Пропустите суспензию для дезагрегации тканей через фильтрационное сетчатое фильтрующее сетчатое фильтрующее ячеечное фильтрующее отверстие 40 мкм в чистую полипропиленовую пробирку объемом 50 мл.
- Промойте фильтрующее сетчатое фильтр с 10 мл охлажденного буфера для толстой кишки, чтобы удалить все клетки, попавшие в фильтр.
11. Усвоение переваривания коллагеназы
- Заполните полипропиленовую коническую трубку объемом 50 мл до края охлажденным буфером для толстой кишки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура толстого буфера имеет решающее значение для обеспечения гашения активности коллагеназы.
- Вращайте при 4 °C и 800 x g в течение 5 минут.
- Выбросьте надосадочную жидкость с помощью вакуумной аспирации.
- Промыть, повторно суспендируя в 25 мл свежего, охлажденного Colon Buffer, с последующим центрифугированием при 4 °C, 800 x g в течение 5 минут.
- Выбросьте надосадочную жидкость с помощью вакуумной аспирации.
- Объедините ресуспендированную гранулу из Collagenase Digestion 1 (шаг 7) в соответствующую пробирку, начиная с шага 11.4.
- Повторите шаг 11.4 (промывка и центрифугирование).
12. Разделение среды на основе диоксида кремния
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 12-13 как можно быстрее, чтобы обеспечить быстрое гашение активности коллагеназы.
- После шага 11.7 повторно суспендируйте каждую гранулу в общей сложности 24 мл 44% разделительной среды на основе диоксида кремния на толстую кишку.
- Медленно нанесите 8 мл среды, полученной на этапе 12.1, на каждую из трех пробирок, приготовленных на этапе 5.2 (содержащих 66% среды для разделения плотности на основе диоксида кремния), используя серологическую пипетку объемом 10 мл. Поддерживайте постоянный и медленный поток разделительного материала с плотностью 44% при одновременном наложении градиента, чтобы избежать нарушения работы интерфейса.
- Тщательно отбалансируйте все пробирки в ведре центрифуги с помощью весов или весов.
- Вращайте пробирки в течение 20 мин при давлении 859 x g в центрифуге без тормоза при температуре 20 °C. Перед извлечением пробирок дайте роторам полностью отдохнуть, стараясь не повредить ячейки на границе раздела градиента.
13. Сбор мононуклеарных ячеек из интерфейса Gradient
- Визуализируйте границу раздела градиента (около отметки 5 мл), где обычно присутствует белая полоса толщиной 1-2 мм (содержащая MNC).
заметка: Белую полосу можно увидеть, а можно и не увидеть. Тем не менее, MNC будет находиться на этом интерфейсе и должен затуманить ясность интерфейса градиента.
- Вакуумируйте аспирацию и выбросьте верхние 7 мл верхнего градиента, чтобы облегчить доступ пипетки к интерфейсу.
- Используя непрерывное ручное отсасывание и равномерное вращательное движение запястья, соберите приграничный слой клеток в чистую полипропиленовую коническую пробирку объемом 50 мл. Собирайте до тех пор, пока граница раздела между двумя градиентами не станет прозрачной и рефракционной (свободной от клеток).
- Заполните пробирку для сбора 50 мл охлажденного буфера FACS. Отжим при 4 °C, 800 x g в течение 5 минут.
- Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью вакуумной аспирации и ресуспендируйте гранулу в 1 мл буфера FACS.
- Подсчитайте клетки на гемоцитометре в соотношении 1:2 с использованием соответствующих методов исключения мертвых клеток.
- Приступайте к окрашиванию FACS или другим анализам с помощью свежевыделенной толстой кишки MNC.
Таблица 1: Таблица приготовления раствора
| решение | формула |
| Буфер двоеточия | 500 мл RPMI + 10 мМ HEPES + 10% FBS (инактивирован при температуре 56°C в течение 60 минут, pH отрегулирован до 7,3) |
| Градиентная среда на основе диоксида кремния 100% (на двоеточие) | 22,5 мл градиентной среды на основе диоксида кремния + 2,5 мл 10x PBS. |
| Градиентная среда плотности на основе диоксида кремния 66% (на толстую кишку) | 10,72 мл градиентной среды плотности на основе диоксида кремния 100% + 5,28 мл буфера для толстой кишки |
| Градиентная среда на основе диоксида кремния 44% (на толстую кишку) | 11 мл градиентной среды плотности на основе диоксида кремния 100% + 14 мл буфера для толстой кишки |
| Буфер для переваривания коллагеназы (на толстую кишку) | 100 ЕД/мл коллагеназы Е из Clostridium histolyticum, растворенной в 40 мл толстого буфера |
| Буфер FACS | 500 мл 1x PBS + 5 г BSA + 1 мм ЭДТА + 0,2 г азида натрия |