Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были проверены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Создание 3D органоидов желудочного дна, полученных от человека
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать загрязнения, выполняйте протокол полностью в капюшоне для стерильных тканей. Ткань дна человека была собрана у пациентов, перенесших рукавную гастрэктомию.
- Соберите ткань у пациентов, перенесших рукавную гастрэктомию, и поместите ее в ледяной безфосфатный буферный физиологический раствор Дульбекко (DPBS) без Ca2+/Mg 2+ в большом пластиковом контейнере.
- С помощью щипцов энергично промойте ткань в стерильном стакане, содержащем 100 мл Ca2+/Mg2+-free DPBS. Мойте в течение примерно 30 секунд или до тех пор, пока не будут удалены мусор и кровь. Далее, используя стерильную марлю, сотрите слизистый слой с эпителия.
- С помощью больших щипцов крепко захватите мышечный слой ткани и с силой соскребите эпителий с помощью больших изогнутых кровоостанавливающих щипцов. Соберите соскобленные фрагменты эпителия в стерильную полистирольную чашку Петри.
- Измельчите эпителиальную ткань до фрагментов размером примерно 2,0 x 2,0 мм2 с помощью бритв для оптимизации переваривания тканей. Промойте фрагменты ткани Ca2+/Mg2+ -free DBPS с добавлением антибиотиков (Ca2+/Mg2+ -free DPBS, 1% Пенициллин/Стрептомицин, 0,25 мг/мл Amphotericin B/10 мг/мл Gentamicin, 50 мг/мл Kanamycin), пока в промывке не освободится кровь. При необходимости выполните несколько стирок. Выбросьте средства для стирки, осторожно профильтровав их через стерильную марлю в стакан для отходов.
- Соберите промытые фрагменты в стеклянную колбу с круглым дном объемом 125 мл с перемешивающей планкой 25 мм и предварительно подогретой инкубационной средой (базальная среда с добавлением 2 мМ L-глутамина, 1% пенициллина/стрептомицина, 10 мМ буфера HEPES, 1 мг/мл коллагеназы типа 1, 2 мг/мл альбумина сыворотки бычьего происхождения 2 мг/мл). Запечатайте круглое дно колбы резиновыми перегородками.
- Вставьте спинальную иглу 20G в перегородки и подключите ее к кислородному баллону с резиновым шлангом. Чтобы отфильтровать любые загрязнения, вставьте в трубку папиросную бумагу, чтобы создать фильтр. Включите отток кислорода на минимум. Введите в перегородки 10–15 игл оттока, чтобы избежать разрыва перегородок.
- Закрепите установку на кольцевой подставке с помощью зажимов и поместите в водяную баню, откалиброванную до 37 °C, с помощью мешалочной пластины на 30–45 минут. После инкубации ткани в течение 15 минут удалите 50 мкл инкубационной среды и визуально проверьте наличие диссоциированных желез. Если железы не плотные или не отделились от тканей, оставьте еще на 5–10 минут.
- Сразу после инкубации добавьте 50 мл предварительно подогретого DMEM/F-12 в инкубационную среду с помощью стерильной серологической пипетки или путем выливания непосредственно в инкубационную смесь.
- Процедите смесь желез через стерильную марлю в четыре конические пробирки по 50 мл. Подержите фильтрат на льду в течение 15 минут, чтобы удаленные железы осядли на дно конической трубки. Будьте осторожны, чтобы не потревожить поселившиеся железы; Удалите и сбросить верхние 40 мл надосадочной жидкости с помощью серологической пипетки. Ресуспендируйте оставшиеся 10 мл в 10 мл DPBS с добавлением антибиотиков.
- Равномерно распределите смесь по 5 мл пробирок для клеточных культур. Центрифугируйте в течение 5 минут при 65 x g при 4 °C и осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
заметка: Очень важно выполнять этот этап на льду и не допускать полимеризации матрицы базальной мембраны во время перемешивания. Кроме того, важно визуально проверить плотность железы путем отбора проб на 50 μл. Оптимальная плотность составляет ~70% слияния.
- Затем нанесите на 50 мкл матрицы базальной мембраны 50 мкл с помощью пипетки с широким наконечником. Избегайте образования пузырей во время нанесения покрытия.
- Чтобы матрица базальной мембраны могла полимеризоваться, инкубируйте в течение 10–15 минут при температуре 37 °C. При нанесении покрытия в 12-луночный культуральный планшет добавьте 1 мл среды hFGO (модифицированная среда Eagle от Advanced Dulbecco/среда F-12 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 1% пенициллина/стрептомицина, 0,25 мг/мл амфотерицина B / 10 мг/мл гентамицина, 50 мг/мл канамицина, 10 мМ буфера HEPES, 1 мМ n-актеилцистина, 1 x N2, 1 x B27, 50% среда, кондиционированная Wnt, 20% среда, кондиционированная R-спондином, с добавлением ингибитора костного морфогенетического белка 100 нг/мл, 1 нМ гастрина, 50 нг/мл эпидермального фактора роста, 200 нг/мл фактора роста фибробластов 10, 10 мМ никотинамида и 10 мкМ ингибитора Y-27632 ROCK) на лунку. Если вы не используете 12-луночный планшет для культивирования, добавьте достаточно среды, чтобы погрузить пузырь матрицы базальной мембраны.
- Культивируйте клетки при 37 °C в инкубаторе для культивирования увлажненных клеток с 5% содержаниемCO2. Меняйте носители каждые 4-5 дней.
