$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Приготовление инструментов, питательных сред и блюд
- Автоклавируйте один набор кишечных ножниц, обычные ножницы и щипцы в стерильную емкость.
- Поместите чашку с плоским дном на 96 лунок в инкубатор при температуре 37 °C.
- Приготовьте 10 мл полной питательной среды с реагентами, перечисленными в Таблице материалов.
- Инкубируйте всю среду при температуре 37 °C на водяной бане.
- Восстановите восстановленную базальную мембрану, поместив ее в ведро со льдом. Восстановленная базальная мембрана становится жидкой при 4 °C .
- Заполните четыре чашки Петри холодным фосфатно-солевым буфером или PBS (4 °C).
2. Выделение крипт тонкого кишечника
- Жертвоприношение путем ингаляции CO2 мыши Lgr5-eGFP-IRES-CreERt2 на фоне C57BL6/J. Рассеките брюшину в продольном направлении ножницами.
- Зажмите живот щипцами и разрежьте его поперечно пополам.
- С этого момента с помощью ножниц для кишечника вытащите кишечник и поместите его в чашку Петри, содержащую PBS.
заметка: Ножницы для кишечника имеют острый и тупой кончик. Тупой кончик этих ножниц предназначен для того, чтобы не повредить архитектуру крипта-ворсин при вскрытии кишечника.
- Начните с того, что поместите тупой кончик в живот и осторожно протолкните его через привратник. Продолжайте, разрезая ножницами и вытягивая щипцами.
- Как только весь тонкий кишечник будет открыт в продольном направлении, промойте его в холодном PBS, удерживая щипцами, и аккуратно промойте в растворе PBS U-образными движениями.
- После того, как все остатки стула будут очищены, приступайте к расплющиванию кишечника на разделочной доске просветной стороной вверх. Просветную сторону легко узнать по отсутствию кровеносных сосудов и по ее бледному виду по сравнению с наружной частью.
- С помощью предметного стекла аккуратно удалите ворсинки, соскоблив сплющенный кишечник. Проделайте этот шаг дважды по всей длине ткани.
- Разрежьте тонкую кишку стерильным хирургическим лезвием на кусочки размером 2–5 мм.
- Поместите фрагменты тонкой кишки в пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл ледяного PBS.
- Очистите фрагменты ткани, удалив оставшиеся загрязнения, пипетируя их вверх и вниз в PBS. Выбросьте надосадочную жидкость и повторяйте этот шаг до тех пор, пока PBS не станет полностью чистым.
- Добавьте 15 мл холодного PBS, чтобы довести общий итоговый объем PBS до 25 мл. Добавьте 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и инкубируйте в течение 45 минут на ролике при 4 °C.
- Откажитесь от PBS/EDTA.
- Добавьте 10 мл PBS и отделите крипты, резко пипетируя фрагменты ткани вверх и вниз (не менее трех раз). Соберите надосадочную жидкость.
- Повторите шаг 2.13 четыре раза. Добавьте питательную среду до конечного объема 50 мл.
- Гранулируйте клетки центрифугированием (300 x g в течение 5 минут).
- Повторно суспендируйте гранулу в 10 мл питательной среды и гранулируйте крипты центрифугированием (80 x g в течение 3 минут).