Выделение колонии метастатических раковых клеток из куриного КАМ: процедура выделения раковых клеток из культур яиц без скорлупы

Аннотация

Источник: Столетов, К. и др. Открытие регуляторов метастазов с использованием быстрой и количественной прижизненной модели хориоаллантоисной мембраны цыплят. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео мы описываем выделение колоний метастатических раковых клеток из хориоаллантоисной мембраны курицы (CAM) с использованием культуры яиц без скорлупы. Этот метод помогает выявить факторы, которые могут быть ответственны за метастазирование рака.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Выделение метастатических колоний

1. На 5-й день после инъекции извлеките эмбрионы из инкубатора и осмотрите CAMs эмбрионов на предмет метастатического распределения колоний. Определите эмбрионы с равномерным распределением колоний, в которых присутствуют компактные (или чрезмерно инвазивные) колонии.
   заметка: Процесс культивирования куриных эмбрионов не является стерильным, поэтому все этапы скрининга должны выполняться в условиях высокой чистоты, чтобы избежать загрязнения культуры тканей в будущем. Заражение встречается довольно редко, и его можно легко избежать, надев перчатки и маску и используя только стерильные инструменты во время процедур инъекции клеток и изоляции колоний. Рекомендуется осматривать эмбрионы один за другим, чтобы уменьшить их воздействие на окружающую лабораторную температуру и предотвратить загрязнение.
2. Найдите интересующую метастатическую колонию. Компактную колонию можно описать как колонию, в которой большинство раковых клеток расположены в пределах ограниченной области в ткани CAM («клетки кажутся «слипшимися вместе»). Инвазивную колонию можно описать как колонию, в которой раковые клетки «рассеиваются» в ткани CAM (рис. 1A, B).
   Примечание: «Компактность» метастатической колонии может быть объяснена либо ингибированием инвазии раковых клеток, либо ингибированием пролиферации раковых клеток, либо и тем, и другим. Следует обратить внимание на все сценарии, а контактные колонии следует изолировать (рис. 1А, Б). Простой флуоресцентный стереомикроскоп может быть использован для различения компактных и инвазивных метастатических колонийных фенотипов.
3. Под диссекционным микроскопом аккуратно потяните ткань CAM, содержащую интересующую метастатическую колонию, вверх с помощью тонких щипцов (рис. 1C).
4. Отрежьте ткань CAM, содержащую колонию метастазов, с помощью хирургических ножниц.
5. Перенесите ткань CAM, содержащую колонию метастазов, в пустую стерильную пробирку объемом 1,5 мл (на льду) и закройте крышку пробирки.
   заметка: Изолированные колонии могут содержаться на льду до 3 ч без потери жизнеспособности.
6. Повторяйте процедуру иссечения до тех пор, пока все интересующие колонии не будут собраны в отдельные пробирки. Чтобы избежать страданий животных, не иссекайте более 2–3 колоний от одного эмбриона. Усыпляйте эмбрионы путем замораживания при температуре -20 °C (или другим одобренным методом) сразу после иссечения колонии.
7. Аккуратно измельчите салфетку CAM в микроцентрифужной пробирке с помощью стерильной иглы 18G. Используйте отдельную иглу для каждой колонии.
8. Добавьте 100 μл 1x раствора коллагеназы и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C.
9. Вращайте клетки и ткань CAM при 300 x g в течение 5 минут при температуре окружающей среды.
10. Аспирируйте раствор коллагеназы и ресуспендируйте клетки в готовых средах, используемых для исследуемой клеточной линии.
    заметка: Как правило, ткань КАМ не полностью диссоциирована после лечения коллагеназой, и раковые клетки сначала пролиферируют внутри частей ткани КАМ и только позже мигрируют на чашку для культуры тканей.
11. Снова вращайте клетки и ткань CAM при 300 x g в течение 5 минут при температуре окружающей среды.
12. Ресуспендируйте клетки и кусочки ткани CAM в 1 мл полной среды плюс коэффициент отбора (если есть), затем перенесите в одну 12-луночную чашку для культуры тканей.
    заметка: Фибробласты CAM курицы могут сохраняться в культуре тканей в течение нескольких пассажей, ингибируя клональную экспансию. Способность расширять метастатические колонии в присутствии фактора отбора (т.е. если вектор, который был использован для придания раковым клеткам флуоресцентности, также кодирует ген устойчивости к антибиотикам у млекопитающих) может значительно ускорить клональную экспансию. Перед скринингом следует провести эксперимент с кривой убийства, чтобы убедиться в том, что используется правильная концентрация антибиотиков.
13. В течение следующих 1–3 недель ежедневно контролируйте рост и загрязнение раковых клеток.
14. Когда клетки достигнут 70–80% конфлюенции, перенесите клетки в культуральную чашку большего объема.
    заметка: Рекомендуется расширять клетки до тех пор, пока не будет заморожено по крайней мере два криогенных флакона каждого клона. Поддержание большого количества культуры тканей может быть трудоемким и ненужным.
15. Приступайте к секвенированию или следующему раунду отбора, как только будет достигнуто достаточное количество раковых клеток. Как правило, 1 x 10⁶ раковых клеток достаточно для современных методов высокопроизводительного секвенирования.
16. Перейдите к повторной инъекции клона, визуализации и количественной оценке компактности колонии или контакта раковых клеток с кровеносными сосудами (Рисунок 2A). В качестве альтернативы можно перейти к высокопроизводительному секвенированию или повторить отбор колоний.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить количество ложных срабатываний, рекомендуется провести как минимум два раунда выбора. Были успешно использованы два подхода. 1) Размножите каждый клон и повторно введите его по отдельности, чтобы подтвердить фенотип колонии. 2) Смешайте все расширенные клоны в соотношении 1:1 каждый, повторно введите в виде смеси и повторите цикл отбора.

Результаты

Рисунок 1. Репрезентативные результаты для различных этапов протокола скрининга.(А) Метастатические колонии, образованные гетерогенными (библиотечными трансдуцированными клетками раковой клеточной линии HEp3), через 5 дней после инъекции. Красной стрелкой показана компактная колония (потенциальное положительное попадание), которую следует вырезать. (B) Ме...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Конические центрифужные пробирки объемом 15 мл.	Корнинг	CLS430791-500 шт.
18 калибр x 1 1/2 BD прецизионность игла	БД	BD305196	Мы используем 1,2 мм х 40 мм, это возможно при желании использовать более короткие иглы
Настольная центрифуга.	Доступно множество источников		Любая центрифуга, совместимая с TC, которая может быть использован для понижения ячеек is подходящий
Коллагеназа	сигма	К0130-100МГ
ватные палочки	Доступно множество источников		должен быть стерилизован перед использованием
Питательные среды, подходящие для cell Используемые линии	Доступно множество источников		Мы выращиваем HT1080, HEp3 и b16 cell строк в DMEM, 10% FBS media
Инкубатор для яиц	Доступно множество источников		Точная модель, которая необходима зависит от масштаба экрана. Доступные источники: MGF Company Inc., Саванна, штат Джорджия, или Lyon Electric Company Inc., Чула-Виста, Калифорния
Пробирки EPPENDOR, 1,5мл	сигма	Т4816-250ЭА
Оплодотворенные яйца белых леггорнов	Любой местный поставщик
Тонкие щипцы	Доступно множество источников		должен быть стерилизован перед использованием
Программное обеспечение для анализа изображений			Мы используем Nikon Elements
ПБС (1шт.)	Доступно множество источников
Пластиковые утяжелители	Simport	CA11006-614	Размеры 78x78x25 мм; много Доступны другие источники
маленькие хирургические ножницы	Доступно множество источников		должен быть стерилизован перед использованием
Стереофлуоресцентный микроскоп			Мы используем Zeiss Lumar v12