Выделение и культивирование эпителиальных клеток языка мышей: процедура выделения и культивирования эпителиальных клеток языка на мышиной модели

Аннотация

Источник: Prasad, M. et al. in vitro создание генетически модифицированной клеточной линии рака головы и шеи у мышей с использованием системы аденоассоциированного вируса-Cas9. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео мы описываем выделение эпителиальных клеток из мышиного языка. Эти клетки могут быть дополнительно культивированы для образования клеточных колоний.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Выделение и культивирование первичных клеток

1. Усыпить 6-недельного самца или самку B6; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J путем удушения CO₂ или любым другим протоколом, одобренным IACUC.
   заметка: У этих мышей с выбиванием CRISPR/Cas9 Cre рекомбиназная экспрессия эндонуклеазы cas9 и EGFP управляется промотором CAG. Предшествующая последовательность Lox-Stop-Lox (LSL), присутствующая в геноме этих мышей, предотвращает экспрессию Cas9 и EGFP в отсутствие рекомбиназы Cre. При использовании в сочетании с одиночными направляющими РНК (sgRNAs) и источником Cre они позволяют редактировать один или несколько мышиных генов in vivo или ex vivo.
2. Рассеките язык у усыпленных мышей с помощью хирургических ножниц.
3. Вручную диссоциируйте ткань, измельчив ткань языка на очень мелкие фрагменты с помощью скальпеля. Соберите фрагменты ткани в пробирку объемом 15 мл, содержащую 4,5 мл простой среды RPMI (без сыворотки).
4. Добавьте тройную смесь ферментов (200 μл) (рецепт см. в Таблице 1) к фрагментам ткани.
5. Инкубируйте тканевую и ферментную смесь при температуре 37 °C в течение 30 минут и постукивая по пробирке каждые 10 минут для усиления ферментативной диссоциации ткани.
6. Добавьте 5% фетальную бычью сыворотку (FBS), содержащую HBSS/PBS, в тканевую и ферментную смесь, чтобы остановить действие фермента.
7. Отфильтруйте вышеуказанную клеточную суспензию через стерильную нейлоновую сетку толщиной 70 мкм, чтобы отделить диспергированные клетки от более крупных фрагментов тканей.
8. Промыть отфильтрованную суспензию клеток центрифугированием в течение 300 x g в течение 5 минут в HBSS/PBS при RT.
9. Повторно суспендируйте гранулу в питательной среде (10% FBS в RPMI/DMEM) и выращивайте в 60-миллиметровых культуральных чашках до образования отдельных колоний клеток.
   1. Агрегаты культуральных клеток удерживаются в верхней части фильтра в культуральной чашке диаметром 60 мм, содержащей 3 мл готовой среды (10% FBS в RPMI/DMEM) до образования клеточных колоний.
10. Микроскопически исследуют первичные клетки на наличие контаминации фибробластов через 1 неделю культивирования. Обработать первичные клетки, полученные из агрегатов и клеточных суспензий, 0,25 трипсина 0,02% раствором ЭДТА при 37 °С в течение 1 мин для удаления фибробластов><. заметка: Обычно первичная культура из клеточных агрегатов дает больше колоний по сравнению с одноклеточными суспензиями. Клетки из этих колоний обеспечивают лучшую эффективность трансдукции с помощью AAV-трансдукции.

10X Тройной ферментный стоковый раствор:
Коллагеназа	1 г конс. [10 мг/мл]
Гиалуронидаза	100 мг [1 мг/мл]
ДНКаза	20 000 единиц конечного конс. [200 мг/мл]
ПБС 1Х	Составляйте до 100 мл

Таблица 1: Рецепт буфера, использованного в данном исследовании

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Штаммы мышей
С57BL/6	Энвиго
В6; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAGcas9*,-EGFP)Fezh/J	Лаборатории Джексона	No 24857
кивок. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)	Энвиго
Ферментов
Бензоназа	сигма	Е1014
Коллагеназа IV	Thermo Fisher Scientific	17104019
ДНКаза	Thermo Fisher Scientific	18047019
Гиалуронидаза	МиллипорСигма	Н3506
трипсин	Биологическая промышленность Израиль БейтХаемек Лтд.	03-050-1Б
Питательные среды, химикаты и реактивы
БСА	Амреско	0332-ТАМ-50Г
DMEM	Биологическая промышленность Израиль БейтХаемек Лтд.	01-055-1А
ФБС	Биологическая промышленность Израиль БейтХаемек Лтд.	04-127-1А
HBSS	сигма	Н6648
ПБС	Биологическая промышленность Израиль БейтХаемек Лтд.	02-023-1А
Трис буфер	MERCK Millipore	648311-1КГ
Пластиковые изделия
Фильтр Амикон-УЛЬТРА 100 кДа	Многородность	UFC910024
0,22 мкм стерильные фильтры, 4 мм	Миллэкс	SLGV004SL
0,45 мкм стерильные фильтры, 13 мм	Миллэкс	SLHV013SL
Планшеты для культивирования	Greiner Bio-One
Трубки Falcon	Greiner Bio-One