Предварительная обработка тканей FFPE для РНК CISH: процедура обработки фиксированных формалином залитых парафином срезов тканей для хромогенной гибридизации РНК in situ

Аннотация

Источник: Outh-Gauer, S. et al. хромогенная гибридизация in situ как инструмент для диагностики рака головы и шеи, связанного с ВПЧ. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует шаги, связанные с предварительной обработкой образцов тканей FFPE для хромогенной гибридизации РНК in situ. Процесс предварительной обработки помогает поддерживать целостность нуклеиновых кислот в клетках и общую морфологию тканей.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были проверены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Подготовка материалов

1. Приготовление 1x реагента для извлечения мишени
   1. В большой стакан добавьте 70 мл 10-кратного реагента для извлечения мишени (см. Таблицу материалов) к 630 мл дистиллированной воды.
   2. Поместите стакан на нагревательную пластину с магнитной мешалкой. Накройте его алюминиевой фольгой.
   3. Отварить его содержимое при 100 °C в течение 10–15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте ему закипеть более 30 минут.

2. Предварительная обработка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги следуют "стандартной" рекомендации по предварительной обработке в соответствии с инструкциями производителя для образцов головы и шеи. Сроки выполнения разделов 2.1 и 2.2 могут потребовать корректировки в зависимости от обрабатываемой ткани.

1. Блокада активности пероксидазы
   1. Добавьте 4–6 капель перекиси водорода (см. Таблицу материалов) на каждое предметное стекло и выдержите их в течение 10 минут при комнатной температуре.
   2. Промойте предметные стекла 2 раза в течение 2 минут в дистиллированной воде комнатной температуры.
2. Разрыв связей РНК/тканей
   1. С помощью когтя снимите алюминиевую фольгу с кипящего реагента для извлечения мишени 1x (TTR1x), помещенного на нагревательную пластину, и прекратите помешивать. Медленно и очень осторожно погрузите решетку на 15 минут. Снова накройте стакан алюминиевой фольгой.
      заметка: На этом этапе кипячение должно продолжаться.
      осторожность: Используйте коготь для манипуляций с алюминиевой фольгой и стойкой для скольжения, чтобы избежать ожогов. Обязательно наденьте надлежащие средства индивидуальной защиты, такие как перчатки и лабораторный халат.
   2. С помощью когтя немедленно переведите горячую решетку на водяную баню и промойте ее в течение 2 мин.<бр/> заметка: Следите за тем, чтобы образцы не остыли в TTR1x.
   3. Промойте слайды в свежем 100% этаноле в течение 2 минут.
   4. Дайте предметным стеклам высохнуть при комнатной температуре в течение 2 минут.
3. Создание барьеров
   1. С помощью гидрофобной барьерной ручки (см. Таблицу материалов) нарисуйте барьер вокруг образца. Дайте высохнуть не менее 5 мин.<бр/> заметка: Дайте барьеру по-настоящему высохнуть. Если он изнашивается во время процедуры, не медлите с тем, чтобы вытащить его снова. Не прикасайтесь ручкой к ткани. Протокол можно приостановить на ночь здесь.
4. Переваривание протеазы
   1. Поместите предметные стекла на штатив для слайдов и добавьте ~4 капли Protease Plus на образец (см. Таблицу материалов).
   2. Накройте противень для контроля влажности крышкой и поставьте его в печь для гибридизации на 30 минут при температуре 40 °C.
      заметка: Чтобы предотвратить испарение, убедитесь, что ручка поворота полностью повернута в положение блокировки.
   3. Выньте противень из духовки и снимите решетку.
   4. По одному предметному стеклу за раз быстро удалите лишнюю жидкость и поместите предметное стекло в решетку для слайдов, погруженную в посуду для окрашивания, наполненную дистиллированной водой.
   5. Промойте предметные стекла 2 раза в течение 2 минут в дистиллированной воде комнатной температуры. Постоянно агитируйте.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Духовой шкаф HybEZ (110 В)	Advanced Cell Diagnostics Inc.	321710 (Английский
Штатив для выдвижных тележек HybEZ	Advanced Cell Diagnostics Inc.	300104
Гидрофобная барьерная ручка ImmEdge	Advanced Cell Diagnostics Inc.	310018
РНК-скоп H202 и реагент Protease Plus	Advanced Cell Diagnostics Inc.	322330 (Английский	Пероксид водорода х2 и протеаза плюс х1
РНК-скоп Реагенты для извлечения мишени	Advanced Cell Diagnostics Inc.	No 322000

) )