Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были проверены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Выполнение анализа
ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания секций между этапами инкубации.
- Гибридизация зонда ВПЧ
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием убедитесь, что зонды предварительно нагреты, чтобы растворить любые осадки. На этом этапе вместо зонда ВПЧ также может быть использована пептидил-пролилилизомераза B (PPIB) для положительного контроля или дигидродипиколитриуктаза (DAPB) для отрицательного контроля (см. Таблицу материалов).
- Коснитесь и/или прокрутите предметные стекла, чтобы удалить лишнюю жидкость и поместить их в решетку для слайдов. Добавьте ~4 капли зонда для ВПЧ, чтобы полностью покрыть каждый участок.
- Накройте противень крышкой и поставьте его в духовку на 2 часа при температуре 40 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить испарение, убедитесь, что поворотная ручка полностью повернута в положение блокировки.
- Выньте противень из духовки и снимите решетку.
- По одному слайду за раз, быстро удалите лишнюю жидкость и поместите предметное стекло в решетку для слайдов, погруженную в форму для окрашивания, заполненную буфером для стирки 1x.
- Промойте предметные стекла в буфере для стирки 1x в течение 2 минут при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Повторите это со свежим буфером для стирки 1x.
- Гибридизация AMP1, AMP2, AMP3 и AMP4
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти этапы включают в себя гибридизацию в гибридизационной печи и AMP1–AMP4 из приобретенного набора (см. Таблицу материалов).
- Коснитесь и/или проведите пальцем, чтобы удалить лишнюю жидкость со слайдов и поместить их в решетку для слайдов. Добавьте ~4 капли AMP1, чтобы полностью покрыть каждую секцию.
- Накройте противень крышкой и поставьте в духовку на 30 минут при температуре 40 °C.
- Выньте противень из духовки и снимите решетку.
- По одному слайду за раз, быстро удалите лишнюю жидкость и поместите предметное стекло в решетку для слайдов, погруженную в форму для окрашивания, заполненную буфером для стирки 1x.
- Промойте предметные стекла в буфере для стирки 1x в течение 2 минут при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Повторите это со свежим буфером для стирки 1x.
- Повторите шаги 1.2.1–1.2.5, но используйте ~4 капли AMP2 вместо AMP1 и выдерживайте в течение 15 минут при 40 °C. Промойте предметные стекла 2 раза в течение 2 минут, оба раза в свежем буфере для стирки.
- Повторите шаги 1.2.1–1.2.5, но используйте ~4 капли AMP3 вместо AMP1 и выдерживайте в течение 30 минут при 40 °C. Промойте предметные стекла 2 раза в течение 2 минут, оба раза в буфере для свежей стирки.
- Повторите шаги 1.2.1–1.2.5, но используйте ~4 капли AMP4 вместо AMP1 и выдерживайте в течение 15 минут при 40 °C. Промойте предметные стекла 2 раза в течение 2 минут, оба раза в буфере для свежей стирки.
- Гибридизация AMP5 и AMP6
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги включают в себя не гибридизацию в духовке, а гибридизацию при комнатной температуре. AMP5 и AMP6 поставляются из купленного комплекта (см. Таблицу материалов).
- Коснитесь и/или прокрутите предметные стекла, чтобы удалить лишнюю жидкость и поместить их в решетку для слайдов. Добавьте ~4 капли AMP5, чтобы полностью покрыть каждую секцию.
- Накройте лоток крышкой и выдерживайте 30 минут при комнатной температуре.
- По одной горке за раз, быстро удалите лишнюю жидкость и поместите ее в решетку для слайдов, погруженную в посуду для окрашивания, заполненную 1x буфером для стирки.
- Промойте предметные стекла в буфере для стирки 1x в течение 2 минут при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Повторите это со свежим буфером для стирки 1x.
- Повторите шаги 1.3.1–1.3.4, но используйте ~4 капли AMP6 вместо AMP5 и выдерживайте в течение 15 минут при комнатной температуре. Промойте предметные стекла 2 раза в течение 2 минут, оба раза в свежем буфере для стирки.
