1. Приготовление противоокрашивающих реагентов
- Готовят 50% гематоксилин.
- В вытяжной шкаф добавьте 100 мл гематоксилина I Гилла (см. Таблицу материалов) на 100 мл дистиллированной воды в посуде для окрашивания.
заметка: 50% раствор для окрашивания гематоксилина можно повторно использовать в течение 1 недели.
- Приготовьте 0,02% (масс./об.) аммиачной воды (реагент для воронения).
- В вытяжной шкаф добавьте 1,43 мл 1 Н гидроксида аммония на 250 мл дистиллированной воды в мерном цилиндре или другой емкости. Заклейте цилиндр парафиновой пленкой. Хорошо перемешайте его содержимое в течение 3–5x.
заметка: Для количественного определения анализа крайне важно использовать гидроксид аммония. Реагенты могут быть приготовлены заранее. Убедитесь, что все контейнеры остаются закрытыми.
2. Обнаружение сигнала с помощью 3,3'-диаминобензидина
ВНИМАНИЕ: Диаминобензидин (DAB) токсичен. Соблюдайте соответствующие меры предосторожности и правила безопасности при утилизации и обращении с этим химическим веществом.
- Смешайте равные объемы DAB-A и DAB-B (см. Таблицу материалов) в пробирке соответствующего размера, дозируя одинаковое количество капель каждого раствора. Внесите ~120 μL субстрата DAB на секцию (~2 капли каждого реагента/всего 4). Хорошо перемешайте в 3–5 раз.
- Возьмите каждый предметный предмет по одному со стойки для слайдов и коснитесь и/или пролистайте, чтобы удалить лишнюю жидкость, прежде чем поместить его в штатив для слайдов.
- Нанесите пипеткой ~120 μL DAB на каждый участок ткани. Убедитесь, что секции закрыты, и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Утилизируйте оставшийся DAB в соответствии с местными нормами и вставьте предметное стекло в решетку для слайдов, погруженную в форму для окрашивания, наполненную водопроводной водой.
3. Противоокрашивание
- Переместите решетку для слайдов в чашку для окрашивания, содержащую 50% раствор для окрашивания гематоксилина, дайте ей отдохнуть 30 с при комнатной температуре. Обратите внимание, что горки станут фиолетовыми.
- Немедленно перенесите решетку для слайдов обратно в тарелку для окрашивания водой из-под крана и промойте слайды 3–5 раз, перемещая решетку вверх и вниз.
- Продолжайте повторять этап мытья свежей водой из-под крана, пока стекла не станут прозрачными, а пряди не останутся фиолетовыми.
- Замените водопроводную воду в посуде для окрашивания 0,02% аммиачной водой. Перемещайте стойку вверх и вниз в 2–3 раза. Учтите, что участок ткани должен стать синим.
- Замените аммиачную воду водопроводной. Вымойте горки в 3–5 раз.
4. Обезвоживание
- Переместите решетку для слайдов в тарелку для окрашивания, содержащую 70% этанола в вытяжном шкафу, и дайте ей отдохнуть в течение 2 минут, периодически перемешивая.
- Переместите решетку для слайдов в первую форму для окрашивания, содержащую 100% этанол, и дайте ей отдохнуть в течение 2 минут, периодически перемешивая.
- Переместите решетку для слайдов во вторую тарелку, содержащую 100% этанол, и дайте ей отдохнуть в течение 2 минут, периодически перемешивая.
- Переместите решетку для слайдов в тарелку для окрашивания, содержащую ксилол, и дайте ей отдохнуть в течение 5 минут, периодически помешивая.
5. Монтаж слайдов
- Снимите слайды с решетки для слайдов и положите их на плоскую поверхность вытяжным шкафом секциями вверх.
- Устанавливайте по одному предметному стеклу за раз, добавляя 1 каплю монтажного материала на основе ксилола к каждому предметному стеклу и осторожно надевая покровное стекло размером 24 мм x 50 мм на секцию. Избегайте попадания пузырьков воздуха.
- Высушите слайды на воздухе в течение ≥5 минут.
6. Оценка образца
- Исследуйте срезы тканей под стандартным светлопольным микроскопом с увеличением 20–40 раз.
