Извлечение DRG из позвоночника крысы: процедура извлечения ганглия дорсального корешка из позвоночника модели крысы

Аннотация

Источник: Schmidt, L. B. et al. Модель хориоаллантоисной мембраны цыплят in vivo для оценки периневральной инвазии при раке головы и шеи. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео мы демонстрируем извлечение ганглия дорсального корешка или DRG из собранного позвоночника крысы для последующих применений.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Сбор урожая и подготовка DRG (ориентировочное время: 2 часа, день 8)

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты с мышами и крысами требуют одобрения IACUC. В некоторых странах употребление куриных яиц также требует одобрения.

1. Возьмите шести-семинедельных крыс Sprague Dawley (весом ~200 г) для извлечения DRG.
   заметка: Одна крыса должна дать ~40 шейных и грудных DRG. DRG мыши также интегрируется в CAM; Однако условия содержания для этого вида нужно оптимизировать самостоятельно.
2. В ламинарном проточном шкафу соберите DRG из шейного и грудного отделов в соответствии с протоколом экстракции DRG у мышей, опубликованным в других источниках. На рисунке 1 приведена информация о том, как собирать DRG.
   1. Усыпьте крысу путем пункции сердца после введения кетамина/ксилазина, вводимого внутрибрюшинно. Очистите кожу крысы 70% этанолом и удалите позвоночник крысы ножницами. Не выполняйте вывих шейки матки, так как это может повредить шейные DRG.
   2. Разделите шейный, грудной и поясничный отделы с помощью одних и тех же ножниц, следуя схематическому анатомическому изображению и грубым изображениям, представленным на рисунке 1A-D. Поместите срезы позвоночника в 10-сантиметровую чашку для культивирования с 1X PBS, чтобы ткани оставались влажными.
   3. С помощью деликатных ножниц для костей раскройте позвоночные кости в дорсальном и вентральном направлениях, разделив позвоночник на две боковые половины (Рисунок 1E-F). Поместите срезы тканей в чистую 10-сантиметровую посуду со свежим 1X PBS.
   4. С помощью щипцов аккуратно отделите спинной мозг от позвоночных костей, чтобы визуализировать DRG (Рисунок 1G).
   5. С помощью тонких щипцов, проведенных под каждым DRG, захватите его и вытащите из костной полости, в которой он застрял. Не держите DRG напрямую, так как это приведет к повреждению тканей. Не обрезайте пучки аксонов у DRG (рисунок 1H).
      заметка: Избегайте использования поясничных DRG, так как они имеют меньшую интеграцию в CAM. Для определения местоположения области DRG следуйте схематическому рисунку и общим анатомическим изображениям на рисунке 1A-D.
3. Сразу после сбора урожая поместите каждую DRG в питательную среду DMEM, обогащенную 2% пенициллином/стрептомицином (Pen/Strep) и 10% термоинактивированной фетальной сывороткой крупного рогатого скота (FBS), чтобы предотвратить бактериальное загрязнение DRG. Сгруппируйте все DRG в одну и ту же 6-сантиметровую культуральную чашку с 4 мл питательной среды.
4. После сбора всех DRG перенесите их в новую культуральную чашку с питательной средой DMEM, дополненной 2% Pen/Strep плюс 10% FBS и содержащей 1,25 мкг/мл красного флуоресцентного красителя. Инкубировать в течение 1 ч в инкубаторе для клеточных культур.

Результаты

Рисунок 1: Экстракция DRG на 8 день. А. Схема крысы, иллюстрирующая анатомическое расположение позвоночника. Б. Диаграмма конфигурации позвонков крысы с отображением различных частей тела; Зеленый для шейного отдела, темно-синий для грудного, оранжевый для поясничного отдела и голубой для крестцовых позвонков. К-Д. Вентральная сторона поз...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
PBS (1x) pH 7,4	Gibco	# 10010-023	Фосфатно-солевой буфер
Крысы Спрэг Доули (самки)	Лаборатории Чарльза Ривера	Код штамма: 001	6-7 недель (вес 190-210 г)
Тонкие щипцы Dumont #5	Инструменты для точных научных исследований (FST)	# 11254-20	Используется для уборки урожая DRG
Очень тонкие щипцы Грефе, изогнутые	Инструменты для точных научных исследований (FST)	# 11151-10	Используется для пересадки DRG на CAM на 8-й день и для забора ткани CAM на 17-й день
Щипцы Грефе сверхтонкие, прямые	Инструменты для точных научных исследований (FST)	# 11150-10	Используется для пересадки DRG на CAM на 8-й день и для забора ткани CAM на 17-й день
DMEM (1шт.)	Gibco	# 11965-092	Модифицированный Eagle Medium от Dulbeecco
Флуоресцентный краситель CellTracker Red CMTPX	Технологии Life	# К34552	Восстановите 50 г в 40 л ДМСО и храните при -20 °C. Используйте 1 мкл стокового раствора/мл питательной среды
Ручка/стрептококк	Gibco	# 15140-122	10 000 ЕД/мл пеницилина, 10 000 мкг/мл стрептомицина
Привет, FBS	Gibco	# 10082-147	Термоинактивированная фетальная сыворотка крупного рогатого скота
Дмсо	Биореагенты Фишера	# ВР231-100	Диметилсульфоксид