Хориоаллантоисная мембрана цыплят или модель опухоли CAM: метод in Ovo для моделирования периневральной инвазии опухолевых клеток

Аннотация

Источник: Schmidt, L. B. et al. Модель хориоаллантоисной мембраны цыплят in vivo для оценки периневральной инвазии при раке головы и шеи. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео мы описываем метод совместного культивирования ганглиев дорсальных корешков и раковых клеток на хориоаллантоисной мембране цыплят или CAM для изучения периневральной инвазии.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Прививка DRG на CAM (приблизительное время: 40 мин, день 8)

1. Приготовьте чашку для культуры 6 см со средой HBSS для промывки DRG перед имплантацией. Поднесите подготовленные яйцеклетки в шкаф ламинарного потока клеточной культуры. Удалите парафиновую оболочку с яйца (рисунок 1А).
2. Тонкими стерильными щипцами аккуратно захватите один DRG изнутри питательной среды. Опустите его в среду HBSS, чтобы удалить избыток среды, содержащей флуоресцентный краситель. Держите ДРГ очень аккуратно; В противном случае он прилипнет к щипцам.
3. Поместите DRG на CAM, стараясь не проколоть мембрану (рисунок 1B-C). При необходимости используйте еще одну пару щипцов, чтобы помочь отсоединить DRG от кончика щипцов при размещении его на CAM.
   заметка: Поддержание DRG во влажном состоянии с помощью среды HBSS также облегчит отсоединение от щипцов.
4. Накройте яйцо стерильной прозрачной пленочной заправкой. Закройте все окна и проколы, сделанные в яичной скорлупе, чтобы избежать бактериального загрязнения (Рисунок 1D).
5. После прививки DRG во все яйца инкубировать яйца в увлажняющем инкубаторе при температуре 38 °C и влажности 54% в течение 2 суток, без ротации.

2. Прививка опухолевых клеток на CAM (приблизительное время: 1 час 30 минут, день 10)

1. За 48 ч до прививки клеток поместите необходимые клетки в культуральные планшеты. Рассчитайте от 0,5 до 1 x 10⁶ клеток на яйцеклетку для клеток UM-SCC-1, чтобы создать трехмерные опухоли в CAM. Имейте в виду, что номер ячейки может отличаться в зависимости от клеточной линии.
2. Аспирируйте среду и добавьте культуральную среду DMEM, дополненную 1% Pen/Strep плюс 10% FBS и 2,5 мкг/мл зеленого флуоресцентного красителя. Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C в инкубаторе для клеточных культур. Затем проверьте интенсивность флуоресценции на микроскопе, аспирируйте среду, промойте один раз 1X PBS и добавьте 0,25% трипсина в течение 10 минут. Нейтрализовать трипсин с помощью добавки ДМЭМ.
3. Центрифугируйте при 250 x g в течение 4 минут для образования клеточной гранулы. Аспирируйте среду DMEM и ресуспендируйте в HBSS для смывания избытка флуоресцентного красителя. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
4. Принесите яйцеклетки в шкаф для ламинарного потока клеточных культур. С помощью ножниц и щипцов откройте прозрачную пленочную повязку, которая покрывает яйцо (рисунок 1E-F).
5. Снова центрифугируйте рассчитанное количество клеток, аспирируйте среду HBSS и повторно суспендируйте при конечной концентрации от 0,5 до 1 x 10⁶ клеток на 5 μл той же среды (рис. 1G). Приготовьте количество, необходимое для общего количества яиц (5 μл клеточной суспензии на яйцо).
6. Нанесите 5 мкл раствора ячейки на CAM, примерно в 2 мм от DRG (рис. 1H). Соблюдайте равномерное расстояние между DRG и ячейками. Будьте очень осторожны, чтобы не потревожить яйцеклетку, чтобы свести к минимуму распространение клеток.
   заметка: Чтобы начать имплантацию клеток, выбирайте яйцеклетки, на которых поверхность CAM визуально сухая. Если поверхность слишком влажная, клетки могут распространяться и не образовывать регулярных опухолей.
7. Накройте яйцо новой пленочной повязкой, как в пункте 1.4. Прививайте клетки во все яйцеклетки. Инкубируйте яйца в увлажняющем инкубаторе при температуре 38 °C и влажности 54% в течение 7 дней, без вращения.

Результаты

Рисунок 1: Прививка DRG, клеток и забор CAM: На 8-й день: А. КАМ легко обнаруживается после удаления парафиновой мембраны. В-С. С помощью тонких щипцов DRG помещается на CAM. D. Яйцо накрывают пленочной заправкой и помещают в инкубатор; На 10-й день: В-Пт. Пленочная повязка снимается и располагается ДРГ (стрелка на F).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Инкубатор для яиц	Цифровой спортсмен GQF	#1502	Инкубатор для яиц оснащен автоматическим ротатором, цифровым термостатом, контролем температуры и влажности
Гравировальный резак	ДРЕМЕЛЬ	#108	Используется для сверления скорлупы яиц
Очень тонкие щипцы Грефе, изогнутые	Инструменты для точных научных исследований (FST)	#11151-10	Используется для прививки DRG на CAM на 8-й день и для забора CAMtissue на 17-й день
Щипцы Грефе сверхтонкие, прямые	Инструменты для точных научных исследований (FST)	#11150-10	Используется для пересадки DRG на CAM на 8-й день и для забора ткани CAM на 17-й день
Оплодотворенные яйца Ломана Уайт Леггорн			Оплодотворяйте яйцеклетки в первые дни оплодотворения, предпочтительно в первые сутки после оплодотворения. Яйца, используемые в этом протоколе, поставляются с птицефабрики Мичиганского государственного университета.
Фильтрующие щипцы	EMD Millipore	#XX6200006P	Тупые щипцы используются для удаления скорлупы яйца
HBSS (1 шт.)	Gibco	#14025-092	Сбалансированный солевой раствор Хэнка
Парафиновая восковая мембрана	Лабораторная пленка для парапленки	#PM-996	Используется для временного прикрытия отверстий яйцеклеток до прививки DRG на день8
PBS (1x) pH 7,4	Gibco	#10010-023	Фосфатно-солевой буфер
Тегадерм Прозрачная пленочная повязка	3 МИН.	#9505W	Стерильный, 6х7 см используется для закрытия отверстий для яиц во время инкубации