Встраивание 3D-сфероидов в капли агарозного геля: метод сохранения сфероидов для последующего анализа

Аннотация

Источник: Rolver, M. G. et al. Оценка жизнеспособности и гибели клеток в 3D сфероидальных культурах раковых клеток. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео описывает технику встраивания 3D-сфероидов в капли агарозного геля для сохранения. Встроенные 3D-сфероиды могут быть в дальнейшем использованы для последующего анализа.

Протокол

1. Встраивание 3D сфероидов

1. Готовят агарозный гель, в который внедряются сфероиды (только необходимо первое время выполнения протокола)
   1. Смешайте 1 г бакто-агара с 50 мл ddH₂O.
   2. Медленно нагревайте в микроволновой печи до тех пор, пока бакто-агар не растворится и не образуется однородный гель. Не допускайте закипания геля.
   3. Держите бакто-агар в тепле на водяной бане при температуре 60 °C.
   4. Между экспериментами следует поддерживать температуру 4 °C.
2. Встраивание сфероидов
   1. В день 1 для каждого состояния соберите минимум 12 сфероидов в пробирку объемом 1,5 мл.
   2. Умойтесь один раз 1 мл ледяного 1X PBS.
   3. Для закрепления сфероидов добавьте 1 мл 4% параформальдегида.
      заметка: Работу с параформальдегидом следует проводить в вытяжном шкафу.
   4. Дайте им инкубироваться в течение 24 ч при RT.
   5. На 2 день осторожно нагрейте агарозный гель, поместив его в наполненный водой стакан в микроволновую печь. Следите за тем, чтобы гель не закипел. Держите в тепле на настольной нагревательной пластине при температуре 60 °C до использования.
   6. Дважды промойте сфероиды 1 мл ледяного масла 1X PBS.
   7. Аспирируйте большую часть 1X PBS (оставляя около 100 мкл на этом этапе, целесообразно для работы со сфероидами).
   8. Приготовьте пипетку объемом 20 мкл, разрезав кончик пипетки под наклоном, чтобы получить более заостренный наконечник с большим отверстием (рис. 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая часть должна быть выполнена быстро, чтобы обеспечить оптимальный перенос сфероида и избежать затвердевания капель геля. Если нагревательный блок отсутствует, рекомендуется сначала поймать сфероиды, а затем сделать агарозную каплю (т.е. поменяв местами пункты 1.2.9 и 1.2.10).
   9. Сделайте каплю агарозного геля на предметное стекло микроскопа. Поместите предметное стекло на теплый нагревательный блок, чтобы агароза не застыла.
   10. С помощью модифицированного наконечника для пипетки (шаг 1.2.8) улавливают как можно больше сфероидов в объеме 15–20 мкл.
   11. Осторожно введите 15–20 мкл сфероида, содержащего 1X PBS, в центр капли агарозного геля, не касаясь предметного стекла микроскопа.
       заметка: Это немного сложный момент. Сфероиды будут потеряны, если наконечник пипетки будет касаться предметного стекла микроскопа при введении сфероидов в гелевую каплю. Желательно отрабатывать весь процесс приготовления агарозной капли и введения сфероидов путем введения в каплю цветной жидкости. Это позволит визуализировать потенциальное проникновение через каплю, так как окрашенная жидкость будет вытекать на предметное стекло.
   12. Дайте каплям агарозного геля застыть путем инкубации в течение 5–10 минут при RT или при 4 °C. Как только гелевая капля немного застынет (но все еще довольно мягкая), осторожно вытолкните гелевую каплю со предметного стекла микроскопа в пластиковую тканевую кассету с помощью скальпеля.
   13. Накройте пластиковые кассеты для салфеток 70% этанолом.<бр/> заметка: На этом этапе сфероиды можно использовать непосредственно или хранить в течение нескольких месяцев.
   14. Сфероид, залитый агарозой, погрузить в парафин, разрезать на предметные стекла толщиной 2–3 мкм и окрашивать гематоксилином и эозином или подвергнуть иммуногистологическому окрашиванию.

Результаты

Рисунок 1: Фиксация, встраивание и иммуногистохимический анализ сфероидов. (A) Схематическое изображение протокола встраивания сфероидов. Отдельные шаги обозначены как (i-vii). (B) Изображение встроенного сфероида MDA-MB-231. Масштабная линейка: 50 мкм. (C) Репрезентативное изображение сфероида MDA-MB-231, обработанного х...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бактоагар	BD Bioscience	#214010	Используется для приготовления агарозного геля
формальдегид	VWR Химикаты	#9713.1000	Используется для фиксации клеток
Medim Uni-safe casette	Medim Histotechnologie	10-0114 (Английский	Используется для хранения внедренных сфероидов
Адгезионная горка Superfrost Ultra-Plus	Менцель-Глезер	#J3800AMNZ	Предметное стекло микроскопа, используемое для встраивания
CellTiter-Glo 3D анализ жизнеспособности клеток	Компания Promega	#G9681	Используется для анализа жизнеспособности клеток

)