$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Подготовка внеклеточного матрикса языка (ПЭМ)
- Казните мышей по вывиху шейки матки и удалите языки с помощью стерильных хирургических ножниц и пинцета.
- Погрузите языки в 75% этанол на 3 минуты, затем поместите каждый язык в пробирку Eppendorf (EP) объемом 1,5 мл с 1 мл 10 мл стерильного фосфатно-буферного раствора (PBS).
заметка: Концентрация PBS на всех последующих этапах такая же, как и концентрация на этом этапе.
- Лизис клеток методом замораживания-размораживания: Заморозьте языки в пробирках EP при температуре -80 °C в течение 1 часа, а затем разморозьте языки при комнатной температуре в течение 45 минут в течение 3 циклов.
- Наденьте каждый язык на кусок хирургического шва с помощью хирургической иглы и оберните конец шва небольшим кусочком стерильной фольги. Операцию проводят в чашке для культивирования размером 3,5 см или 6 см, содержащей 75% этанола, в стерильных условиях.
заметка: Подходящая длина каждого куска хирургического шовного материала составляет около 20 см, а соответствующий размер каждого куска фольги составляет около 0,3 см2 (1 см х 0,3 см). Язычок должен быть загружен рядом с фольгой.
- Промойте каждый язык 3 мл стерильного PBS в чашке для культивирования 3,5 см или 6 см в течение 30 с. Выполняйте эту операцию в стерильных условиях.
- Промойте языки сверхчистой водой: Добавьте ампициллин в бутылку с широким горлышком с 250 мл стерильной сверхчистой воды до конечной концентрации 90 мкг/мл. Положите языки в бутылку с мешалкой. Затяните крышку флакона так, чтобы часть шва осталась снаружи флакона. Выполняйте эту операцию в стерильных условиях.
заметка: В одну бутылку можно поместить до 5 язычков с учетом переплетения швов. Фольга находится на конце шва в бутылке, чтобы язык не соскальзывал. Язычки следует располагать на высоте 2 см от дна бутылки, регулируя длину шва, оставшегося внутри бутылки. Это примечание также относится к шагам 1.8, 1.10, 1.12 и 1.16.
- Поставьте бутылку на магнитную мешалку на 12 часов.
- Промойте языки NaCl: Добавьте ампициллин в бутылку с широким горлышком с 250 мл стерильного 1 М NaCl до конечной концентрации 90 мкг/мл. Переместите языки и перемешиватель в бутылку. Затяните крышку флакона так, чтобы часть шва осталась снаружи флакона. Выполняют эту операцию в стерильных условиях.
- Поставьте бутылку на магнитную мешалку на 24 часа.
- Лизис клеток с помощью Triton X-100: Добавьте ампициллин до конечной концентрации 90 мкг/мл в флакон с широким горлышком с 250 мл стерильного 2% Triton X-100 в PBS. Переместите языки и перемешиватель в бутылку. Затяните крышку флакона так, чтобы часть шва осталась снаружи флакона. Выполняют эту операцию в стерильных условиях.
- Поставьте бутылку на магнитную мешалку на 48 ч.
- Промойте языки CaCl2/MgCl2: Добавьте ампициллин в флакон с широким горлышком с 250 мл стерильного 5 мМ CaCl2/MgCl2 до конечной концентрации 90 мкг/мл. Переместите языки и перемешиватель в бутылку. Затяните крышку флакона так, чтобы часть шва осталась снаружи флакона. Выполняют эту операцию в стерильных условиях.
- Поставьте бутылку на магнитную мешалку на 24 часа.
- Разложение с помощью ДНКазы: Добавьте 1 мл сбалансированного раствора соли Хэнка (HBSS) в каждую пробирку EP. Добавьте ДНКазу в HBSS соответственно до конечной концентрации 300 мкМ. Переместите каждый язычок в каждую пробирку EP, причем часть шовной нити должна находиться за пределами трубки. Выполняйте эту операцию в стерильных условиях.
заметка: Убедитесь, что часть шовной нити, оставшаяся внутри бутылок на предыдущих этапах, также остается внутри EP-трубки на этом этапе, и убедитесь, что часть шва, оставшаяся за пределами бутылок на предыдущих этапах, также остается за пределами EP-трубки на этом этапе.
- Инкубируйте языки в пробирках EP при температуре 37 °C в течение 24 часов.
- Промойте языки PBS: Добавьте ампициллин во флакон с широким горлышком с 250 мл стерильного PBS до конечной концентрации 90 мкг/мл. Переместите языки и перемешиватель в бутылку. Затяните крышку флакона так, чтобы часть шва осталась снаружи флакона. Выполняют эту операцию в стерильных условиях.
- Поставьте бутылку на магнитную мешалку на 24 часа.
- Приготовленный ПЭМ хранить в стерильной ПБС при температуре 4 °С до использования.