Методическая статья

Криофрезерование децеллюляризованной ткани: методика получения мелкодисперсного порошка внеклеточного матрикса

30 апреля 2023 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Kornmuller, A. et al. Производство пен и микроносителей, полученных из внеклеточного матрикса, в качестве тканеспецифических клеточных культур и платформ доставки. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео мы представляем протокол получения тонко измельченного порошка внеклеточного матрикса из лиофилизированной децеллюляризированной ткани методом криофрезерования. Порошкообразный ЭХМ сохраняет свой биохимический состав и может быть использован для синтеза микроносителей.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Обработка децеллюляризованных тканей

  1. Децеллюляризация и лиофилизация
    1. Децеллюляризируйте представляющие интерес ткани в соответствии с установленным протоколом.
      заметка: Скаффолды в настоящем исследовании были подготовлены в соответствии с опубликованными протоколами децеллюляризации для DAT человека, ДДТ свиней и DLV свиней. Коммерчески доступный нерастворимый коллаген также может быть использован для изготовления пен и микроносителей, таких как коллаген, полученный из бычьих сухожилий, который успешно используется в диапазоне концентраций 10–50 мг/мл. Другие нерастворимые источники коллагена могут быть использованы, но могут потребовать оптимизации для определения диапазона концентраций, в котором получаются стабильные каркасы.
    2. Переложите гидратированную децеллюляризованную ткань или очищенный коллаген в центрифужную пробирку объемом 50 мл с помощью щипцов и добавьте достаточное количество воды двойной дистиллированной (ddH₂O) для погружения ткани до максимального общего объема 35 мл.
    3. Заморозьте образец на ночь при температуре -80 °C, расположив трубку центрифуги горизонтально во время замораживания, чтобы максимально увеличить площадь поверхности для сублимации во время последующей лиофилизации.
    4. Снимите крышку с пробирки центрифуги и переложите замороженный образец в банку для лиофилизации.
    5. Лиофилизируйте образец с помощью лабораторной сублимационной сушилки в течение 48–72 часов или до полного высыхания.
      заметка: Время сушки может варьироваться для разных лиофилизаторов и децеллюляризованных тканей.
    6. Лиофилизированный ЭКМ мелко измельчить на мелкие кусочки (~1–2 мм3) с помощью острых хирургических ножниц.
    7. Храните измельченный ЭБУ в эксикаторе до готовности к дальнейшей обработке.
      заметка: Рекомендуется использовать измельченный ECM немедленно, чтобы предотвратить поглощение влаги из окружающей среды.
  2. Криофрезерование (опционально для изготовления пенопласта)
    1. Заполните фрезерную камеру из нержавеющей стали объемом 25 мл для лабораторной шаровой мельницы измельченным лиофилизированным ECM и добавьте два фрезерных шара из нержавеющей стали 10 мм.
    2. Закройте и полностью погрузите загруженную камеру измельчения в жидкий азот на 3 минуты.
    3. Измельчите замороженный образец в течение 3 минут при частоте 30 Гц (1 800 об/мин).
    4. Повторяйте шаги 1.2.2 и 1.2.3 до тех пор, пока ECM не превратится в мелкий порошок.
      заметка: Количество повторений этих шагов может варьироваться в зависимости от источника ECM. Например, для DAT обычно требуется 3 цикла измельчения для получения мелкодисперсного порошка.
    5. Переложите порошок с помощью мерной ложки в стеклянный флакон, плотно закройте и храните в эксикаторе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Зажимные поводки типа «АллигаторВВР470149-728
Алюминиевая фольгаНаучный центр ФишераТел.: 01-213-101
аналитические весыСарториусCPA225D
Система криофрезерованияРетчNo 20.745.0001ММ 400
ДессикаторНаучный центр Фишера8624426Для хранения лиофилизированных ЭБУ и биоскаффолдов
Фляга ДьюараНаучный центр Фишера10-196-6Низкая форма; диапазон объема 250 - 500 мл
Двойная дистиллированная вода (ddH2O)От Barnstead GenPure xCAD Система очистки воды
ECM (внеклеточный матрикс)Выделен из жировой ткани человека, дермы свиньи или миокарда свиньи, как описано в Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 и Wainwright et al. 2010
щипцыВВР37-501-32 (АнглийскийДля переноса пены
Морозильная камера (-20 °C)ВВР97043-346
Морозильная камера (-80 °C)Термо СайентиалEXF40086A
Стеклянные флаконыНаучный центр Фишера03-339-26ДДля хранения лиофилизированных криофрезерованных ЭХМ
Жидкий азотДля электронапыления
ЛиофилизаторЛабконко7750021Свободная зона4.5
Камера измельченияРетч02.462.0213 (АнглийскийРекомендуемый объем 25 мл
Шары для помолаВВР16003-606Диаметр 10 мм, рекомендуется нержавеющая сталь
Пенициллин-стрептомицинТехнологии Life15140-122Используется для сред распространения
Пипет-Эйд ХРМандель СайентификДРУ-4-000-101
СкупулаВВР89259-968Для сбора микроносителей
Хирургические ножницыВВР82027-590
» ) ) гг.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи