Получение суспензии ЭКМ: метод получения гомогенной суспензии из внеклеточного матрикса, полученного из ткани

Аннотация

Источник: Kornmuller, A. et al. Производство пенопластов и микроносителей, полученных из внеклеточного матрикса, в качестве тканеспецифических клеточных культур и платформ доставки. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео описывается приготовление гомогенизированной и переваренной суспензии внеклеточного матрикса из децеллюляризованных и лиофилизированных тканей. Этот метод помогает в изготовлении пористых пенопластов и микроносителей, полученных из ECM, для использования в качестве субстратов в передовых 3D-моделях клеточных культур.

Протокол

1. Обработка децеллюляризованных тканей

1. Децеллюляризация и лиофилизация
   1. Децеллюляризируйте представляющие интерес ткани в соответствии с установленным протоколом.
      заметка: Скаффолды в настоящем исследовании были подготовлены в соответствии с опубликованными протоколами децеллюляризации децеллюляризованной жировой ткани человека (DAT), децеллюляризованной дермальной ткани свиньи (ДДТ) и децеллюляризованного левого желудочка свиньи (DLV). Коммерчески доступный нерастворимый коллаген также может быть использован для изготовления пен и микроносителей, таких как коллаген, полученный из бычьих сухожилий, который успешно используется в диапазоне концентраций 10–50 мг/мл. Другие нерастворимые источники коллагена могут быть использованы, но могут потребовать оптимизации для определения диапазона концентраций, в котором получаются стабильные каркасы.
   2. Перенесите гидратированную децеллюляризованную ткань или очищенный коллаген в центрифужную пробирку объемом 50 мл с помощью щипцов и добавьте достаточное количество двойной дистиллированной воды (ddH₂O) для погружения ткани до максимального общего объема 35 мл.
   3. Заморозьте образец на ночь при температуре -80 °C, расположив трубку центрифуги горизонтально во время замораживания, чтобы максимально увеличить площадь поверхности для сублимации во время последующей лиофилизации.
   4. Снимите крышку с пробирки центрифуги и переложите замороженный образец в банку для лиофилизации.
   5. Лиофилизируйте образец с помощью лабораторной сублимационной сушилки в течение 48–72 часов или до полного высыхания.
      заметка: Время сушки может варьироваться для разных лиофилизаторов и децеллюляризованных тканей.
   6. Лиофилизированный ЭКМ мелко измельчить на мелкие кусочки (~1–2^мм3) с помощью острых хирургических ножниц.
   7. Храните измельченный ЭБУ в эксикаторе до готовности к дальнейшей обработке.
      заметка: Рекомендуется использовать измельченный ECM немедленно, чтобы предотвратить поглощение влаги из окружающей среды.
2. Криофрезерование
   1. Заполните фрезерную камеру из нержавеющей стали объемом 25 мл для лабораторной шаровой мельницы измельченным лиофилизированным ECM и добавьте два фрезерных шара из нержавеющей стали 10 мм.
   2. Закройте и полностью погрузите загруженную камеру измельчения в жидкий азот на 3 минуты.
   3. Измельчите замороженный образец в течение 3 минут при частоте 30 Гц (1 800 об/мин) в мелкий порошок.
      заметка: Количество повторений этих шагов может варьироваться в зависимости от источника ECM. Например, для DAT обычно требуется 3 цикла измельчения для получения мелкодисперсного порошка.
3. Подготовка суспензии ECM
   1. Отвесьте 250 мг измельченного (для пенопласта) или криоизмельченного (для пенопласта или микроносителей) ЭБУ и переложите его в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Обратитесь к шагу 1.1.6 и разделу 1.2 для приготовления измельченного ЭХМ и криофрезерованного ЭХМ соответственно.
      заметка: Этот протокол предназначен для приготовления суспензии ЭКМ в дозе 50 мг/мл, которая рекомендуется для ДАТ человека, ДДТ свиней и ДЛВ свиней. В зависимости от конкретного источника ECM могут образовываться однородные суспензии при более высоких или более низких начальных концентрациях.
   2. Добавьте 5 мл 0,22 М буфера₂PO₄ (pH 5,4) в пробирку для центрифуги и отметьте уровень жидкости на пробирке.
   3. Приготовьте стоковый раствор α-амилазы, добавив 7,5 мг α-амилазы в 1 мл 0,22 М₂PO₄ (pH 5,4). Добавьте в образец 100 мкл стокового раствора α-амилазы (0,75 мг α-амилазы: 0,3% мас.% сухой ткани). Добавьте 0,22 М₂PO₄ для получения конечного объема 10 мл.
   4. Непрерывно перемешивайте суспензию при 300 об/мин в течение 72 ч при комнатной температуре.
   5. Центрифугируйте суспензию при давлении 1 500 x g в течение 10 мин. Осторожно соберите и выбросьте надосадочную жидкость, не нарушая переваренную гранулу ECM. Ресуспендируйте гранулированный материал в 10 мл 5% NaCl, разведенного в ddH₂O.
   6. Повторите шаг 1.3.5 в общей сложности два полоскания с 5% NaCl в ddH₂O.
   7. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулированный материал в 10 мл_ddH2O.
   8. Непрерывно перемешивайте суспензию при 300 об/мин в течение 10 мин при RT.
   9. Центрифугируйте суспензию при давлении 1 500 x g в течение 10 мин. Осторожно соберите и выбросьте надосадочную жидкость, не нарушая переваренную гранулу ECM.
   10. Добавьте 0,2 М уксусной кислоты к отметке 5 мл, сделанной на шаге 1.3.2.
   11. Непрерывно перемешивайте суспензию при 120 об/мин O/N при 37 °C.
   12. Гомогенизируйте суспензию ECM при комнатной температуре с интервалом в 10 секунд с помощью ручного гомогенизатора, оснащенного пилообразным зондом шириной 10 мм, до тех пор, пока не останутся видимые фрагменты. Поместите суспензию в стакан с холодной водой между интервалами гомогенизации, чтобы предотвратить перегрев.
       заметка: В зависимости от источника ЭХМ может потребоваться дальнейшее разведение до 0,2 М уксусной кислоты для получения однородной суспензии. Чрезмерное охлаждение суспензии ECM может привести к увеличению вязкости, что может помешать эффективной гомогенизации. Если отмечается увеличение вязкости, образец можно подогреть до 37 °C и подвергнуть дальнейшей обработке.
   13. Хранить при температуре 4 °C в течение одного месяца перед изготовлением пены или микроносителя.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Уксусная кислота, ледяная	БиоШоп	ТУЗ222.5
α-амилаза	сигма	101074694	от Aspergillus aryzae
Центрифуга 75004251	Термо Сайентиал		С качающимся ротором ковша для центрифужных пробирок объемом 15 и 50 мл
Центрифужные пробирки (15 мл)	Сарштедт	No 62.554.205 (Английский
Дессикатор	Научный центр Фишера	8624426	Для хранения лиофилизированных ЭБУ и биоскаффолдов
Двойная дистиллированная вода (ddH2O)			От Barnstead GenPure xCAD Система очистки воды
ECM (внеклеточный матрикс)			Выделен из жировой ткани человека, дермы свиньи или миокарда свиньи, как описано в Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 и Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Ручной гомогенизатор	Научный центр Фишера	Тел.: 14-359-251	Скорость: 8 000 - 30 000 об/мин
Аксессуары для гомогенизаторов: щупы для донышка пилы, щупы	Научный центр Фишера	14-261-17	10 x 95 мм
Жидкий азот
Хлорид натрия	БиоШоп	7647-14-5
Натрия фосфат одноосновной	БиоШоп	10049-21-5
Хирургические ножницы	ВВР	82027-590

)