Получение пены, полученной из внеклеточного матрикса, с помощью лиофилизации: процедура получения биологических каркасов из ВКМ децеллюляризованных тканей

Аннотация

Источник: Kornmuller, A. et al. Производство пен и микроносителей, полученных из внеклеточного матрикса, в качестве тканеспецифических клеточных культур и платформ доставки. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео описывается метод синтеза чистых пен, полученных из ECM, без необходимости химического сшивания. Эти пены, полученные из ECM, находят применение в качестве передовых 3D-моделей клеточных культур in vitro или в качестве прорегенеративных биоскаффолдов.

Протокол

1. Производство пенопласта на основе ECM

1. Гомогенную суспензию ЭХМ готовят путем диспергирования мелкодисперсного порошка ЭХМ в буферном растворе и инкубируют при 37 °С с непрерывным перемешиванием при 120 об/мин до тех пор, пока суспензия не станет теплой.
2. Развести суспензию ECM в 0,2 М уксусной кислоты до нужной концентрации.
   заметка: В зависимости от источника ЭХМ стабильные пены могут быть приготовлены в диапазоне 10–100 мг/мл, при этом рекомендуемым диапазоном для DAT, ДДТ и ДЛВ является 15–50 мг/мл. Как правило, пенопласты, изготовленные в более высоких концентрациях, будут немного менее пористыми, но более стабильными в культуре и более простыми в обращении.
3. С помощью шприца объемом 3 мл с иглой 18G для предотвращения образования пузырьков в суспензии ECM заполните нужную форму суспензией ECM. Для изготовления пен DAT, DDT и DLV дозируйте 400 мкл суспензии ECM 35 мг/мл в 48-луночный планшет, обработанный клеточными культурами.
   заметка: Форма выбранной формы и объем суспензии ECM будут определять геометрию получаемой пены.
4. Накройте крышкой и заморозьте формы на ночь, поместив их в морозильную камеру при температуре -20 °C или -80 °C.
   заметка: Температура замерзания может повлиять на пористость пены. При замораживании образцов при температуре -20 °C по сравнению с -80 °C ожидается увеличение пор из-за образования более крупных кристаллов льда. Для изготовления пенопластов с однородной пористой структурой убедитесь, что форма не соприкасается с проводящей поверхностью, чтобы предотвратить направленное охлаждение.
5. Поместите формы с замороженными образцами в колбу с лиофилизатором. Подключите колбу лиофилизатора к лабораторной сублимационной сушилке и высушите в течение 24 ч.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы образец оставался замороженным до лиофилизации.
6. Храните лиофилизированную пену в эксикаторе до тех пор, пока она не понадобится.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
аналитические весы	Сарториус	CPA225D
Центрифужные пробирки (15 мл)	Сарштедт	No 62.554.205 (Английский
Центрифужные пробирки (50 мл)	Сарштедт	No 62.547.205 (Английский
Коллаген из ахиллова сухожилия крупного рогатого скота /<> сухожилие (нерастворимое)	сигма	С9879	Или аналогичный нерастворимый коллаген источник; Может использоваться как an Альтернатива Decellularized Салфетки для изготовления пенопластов и<бр/> микроносители
Дессикатор	Научный центр Фишера	8624426	Для лиофилизированных ECM и Хранение биоскаффолда
Фляга Дьюара	Научный центр Фишера	10-196-6	Низкая форма; объемный диапазон 250 -500 мл
Двойная дистиллированная вода (ddH_{2} O)			Из Barnstead GenPure xCAD Система очистки воды
D-PBS (фосфатно-буферизованный Солевой раствор)	зубр	311425125
ECM (внеклеточный матрикс)			Выделен из жировой ткани человека ткань, свиная дерма или свиная миокард, как описано в Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, и Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, пункт 32)
щипцы	ВВР	37-501-32 (Английский	Для переноса пены
Морозильная камера (-20 °C)	ВВР	97043-346
Морозильная камера (-80 °C)	Термо Сайентиал	EXF40086A
Стеклянные флаконы	Научный центр Фишера	03-339-26Д	Для хранения лиофилизированных криомиллированных РЭБ
Жидкий азот			Для электронапыления
Лиофилизатор	Лабконко	7750021	Свободная зона4.5
Игла 18 г	ВВР	С ABD305185	Для выдачи суспензии ECM в формы
Шейкер орбитального инкубатора	SciLogex	832010089999	Регулируемая температура (37 °C)
Серологические пипетки (10 мл)	Сарштедт	86.1254.001
Серологические пипетки (25 мл)	Сарштедт	86.1685.001
Хлорид натрия	БиоШоп	7647-14-5
Натрия фосфат одноосновной	БиоШоп	10049-21-5

) ) )