Методическая статья

Изготовление биоскаффолдов методом электрораспыления: метод получения микронесущих скаффолдов, полученных из внеклеточного матрикса децеллюляризованной ткани

30 апреля 2023 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Kornmuller, A. et al. Производство пенопластов и микроносителей, полученных из внеклеточного матрикса, в качестве тканеспецифических клеточных культур и платформ доставки. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует процедуру изготовления микроносителей, полученных из внеклеточного матрикса, с помощью электронапыления. Эти микроносители имитируют нативное тканеспецифичное микроокружение и стабильны в долгосрочных 3D-моделях клеточных культур in vitro.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление микроносителей на основе ECM с помощью электронапыления

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор установки электрораспыления показан на рисунке 1.

  1. Инкубировать предварительно приготовленную криофрезерованную суспензию ECM при 37 °C с непрерывным перемешиванием при 100 об/мин O/N.
    заметка: Криофрезерованный ЭХМ используется для изготовления микроносителей, полученных из ЭХМ, чтобы обеспечить большую однородность суспензии и предотвратить засорение во время электронапыления.
  2. Загрузите 3 мл суспензии ECM в шприц Luer-Lock объемом 3 мл и прикрепите к отверстию шприца крылатый инфузионный набор.
    заметка: Можно использовать ряд игольчатых датчиков, признавая, что выбор может влиять на размер и форму получаемых микроносителей. Для изготовления микроносителей DAT, DDT и DLV используйте иглу 25G.
  3. Закрепите шприц внутри шприцевого насоса. Закрепите иглу на ретортной подставке и расположите кончик иглы вертикально на расстоянии 4–6 см от верхней части колбы Дьюара низкой формы (рекомендуется размер 250–500 мл).
  4. Прикрепите электрод из кожи аллигатора к кончику иглы и подключите его к положительной клемме высоковольтного источника питания.
  5. Сложите полоску алюминиевой фольги (12 х 5 см) по краю вакуумной колбы.
  6. Прикрепите второй электрод из кожи аллигатора к внешнему краю фольги и подключите его к клемме источника заземления блока питания.
  7. Наполните колбу Дьюара жидким азотом примерно на 1 см от верха так, чтобы 3/4 фольги была погружена. <бр/> заметка: Важно, чтобы колба Дьюара была наполнена жидким азотом. Поверхность жидкого азота должна находиться не менее чем в 2 см от верха колбы в процессе электрораспыления. Для поддержания постоянного уровня жидкого азота во время электрораспыления требуется непрерывная дозаправка жидким азотом.
  8. Установите шприцевой насос на скорость инфузии 30 мл/ч. <бр/> заметка: Изменение скорости инфузии может изменить форму и диаметр микроносителя, но рекомендуемый диапазон составляет 25–35 мл/ч. Несмотря на то, что он сильно зависит от вязкости суспензии, скорость потока ниже 25 мл/ч может привести к образованию более крупных микроносителей. При очень низких скоростях потока размер и форма микроносителей могут стать менее однородными. При скорости инфузии выше 35 мл/ч однородность капель, образующихся при электрораспылении, может быть нарушена, что приводит к образованию несферических микроносителей с более широким распределением по размерам.
  9. Подайте напряжение 20 кВ и включите шприцевой насос, чтобы начать электрораспыление.
    заметка: Напряжение может изменяться в зависимости от размера микроносителей и, как правило, оказывает большее влияние на диаметр, чем на скорость инфузии. Рекомендуемый диапазон напряжения — 15–25 кВ. Ожидается уменьшение диаметра микронесущей с повышением напряжения.
  10. После завершения инфузии осторожно слейте излишки жидкого азота из сосуда Дьюара, оставив микроносители во взвешенном состоянии в ~25 мл жидкого азота, чтобы они оставались замороженными.
  11. Немедленно перенесите микроносители с жидким азотом в центрифужную пробирку объемом 50 мл одним плавным движением. Соберите все оставшиеся в Дьюаре замороженные микроносители с помощью совки и добавьте их в пробирку центрифуги.
    заметка: В зависимости от размера сосуда Дьюара, микроносители в жидком азоте могут быть первоначально налиты в сосуд среднего размера, а затем немедленно перенесены в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
  12. Накрыть центрифужную трубку, содержащую микроносители, жидким азотом алюминиевой фольгой, перфорированной с мелкими отверстиями, для подготовки к лиофилизации.
  13. Поместите закрытые центрифужные пробирки в колбу для лиофилизатора. Немедленно подключите колбу к лиофилизатору и высушите образцы O/N.
    заметка: Очень важно держать микроносители во взвешенном состоянии в жидком азоте, чтобы они не оттаивали перед этим этапом, так как размораживание может привести к коллапсу и/или агрегации. Микроносители DAT, DDT и DLV, изготовленные в концентрации 35 мг/мл с использованием описанных выше условий электрораспыления, обычно имеют гидратированный диаметр в диапазоне от 350 до 500 мкм. Распределение по размерам может варьироваться в зависимости от источника ECM.
  14. Храните лиофилизированные микроносители в эксикаторе до тех пор, пока они не понадобятся.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1. Обзор аппарата для электронапыления, используемого при изготовлении микроносителей. A: Изображение, показывающее расположение основного оборудования для электронапыления, включая насос для шприца и источник питания высокого напряжения, а также расположение иглы относительно сосуда Дьюара жидкого азота. B: Схема электронапыления, включая рекомендуемые диапазоны ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Зажимные поводки типа «АллигаторВВР470149-728
Алюминиевая фольгаНаучный центр ФишераТел.: 01-213-101
Центрифужные пробирки (15 мл)СарштедтNo 62.554.205 (Английский
Центрифужные пробирки (50 мл)СарштедтNo 62.547.205 (Английский
Дессикатор Научный центр Фишера 8624426 Для хранения лиофилизированных ЭБУ и биоскаффолдов
Фляга ДьюараНаучный центр Фишера10-196-6Низкая форма; диапазон объема 250 - 500 мл
ECM (внеклеточный матрикс)Выделен из жировой ткани человека, дермы свиньи или миокарда свиньи, как описано в Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 и Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Жидкий азотДля электронапыления
ЛиофилизаторЛабконко7750021Свободная зона4.5
Шейкер орбитального инкубатораSciLogex8.3201Э+11Регулируемая температура (37 °C)
Ретортная стойкаВВР470019-526
Зажим для ретортной стойкиВВР21573-606
Шприц Safety-LokБД309606Шприц с замком Люэра объемом 3 мл для изготовления микроносителей и выдачи суспензии ECM
СкупулаВВР89259-968Для сбора микроносителей
Шприцевой насосВВР10117-490Микропроцессорное управление
Высоковольтный источник питанияГамма-исследования высокого напряженияES30P-5W/DDPMСпособен работать в рекомендуемом диапазоне напряжения 15 - 25 кВ
Крылатый инфузионный наборТерумо22258092Длина трубки 30 см, рекомендуется 25 G 3/4"; Можно использовать другие игольчатые калибры, которые могут влиять на диаметр микроносителя
» ) ) гг.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи