Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Приготовление полутвердых матричных капель (< 1 мин на пластину)
- Поместите предварительно охлажденную стеклянную пластину на ледяную глыбу под операционным микроскопом. Следите за тем, чтобы аликвота матрицы всегда оставалась на льду.
- Поместите каплю матрицы объемом 1,5 мкл в каждый из четырех углов стеклянной нижней пластины с помощью микропипетки объемом 2 мкл или 10 мкл, оставляя расстояние, по крайней мере, такое же, как сама капля от края стеклянной лунки.
- Поместите кончик пипетки прямо на стекло под углом 45 градусов. Медленно пипетируйте матрицу. Медленно отойдите от стеклянного дна после того, как матрица войдет в зацепление на пластине.
заметка: Поверхностное натяжение между матрицей и стеклом должно каждый раз создавать идеальную полусферу.
- Прекратите пипетирование непосредственно перед тем, как наконечник опустеет, так как случайное впрыскивание воздуха в матричную каплю делает диаметр матричной капли намного больше, и его трудно удалить.
заметка: Использование второй руки для стабилизации кисти пипетирования способствует более точному размещению.
2. Введение DRG в капли полутвердой матрицы (< 2 минуты на пластину)
- Оставьте пластину с каплями матрицы на короткое время при комнатной температуре (~1 минута). Это немного ужесточает матрицу, облегчая точное размещение ДРГ.
- Зачерпывайте (не захватывайте) DRG аккуратно закрытыми микроскопическими щипцами в левой руке. Опять же, темный фон на фоне маленькой белой DRG облегчает визуализацию. Перенесите DRG на кончик иглы 21G в правой руке. В результате переноса на щипцах останутся остатки среды.
- Аккуратно введите DRG в середину капли матрицы с помощью иглы 21G (рисунок 1). В большинстве случаев DRG легко выпускается в матрицу, а затем может быть расположен по центру с помощью иглы.
- Если DRG прилипает к иглу, используйте микроскопические щипцы, чтобы оттолкнуть DRG от иглы и ввести его в матричную каплю. Удалите излишки среды с микроскопических щипцов с помощью лабораторной салфетки.
заметка: Введение среды в матрицу приведет к изменению диаметра, объема и консистенции анализа. Ледяная глыба с цветными или цветными надписями обеспечивает контраст фона, что облегчает визуализацию этого тонкого процесса.
- После того, как на пластине есть все четыре DRG, проведите окончательную проверку, чтобы убедиться, что DRG находится в центре капли матрицы. При необходимости отрегулируйте иглу 21G.
- Перенесите готовую пластину в инкубатор с температурой 37 °C. Это укрепит полутвердую матрицу и зафиксирует ДРГ в нужном положении.
- Повторите этот процесс для всех DRG. Поместите капли пустой матрицы без DRG в качестве отрицательного элемента управления.
- Добавьте 4 мл DMEM с 10% FBS средой на каждую пластину со стеклянным дном после заполнения всех пластин и выдержки их в инкубаторе при температуре 37 °C в течение не менее 3 мин. Поместите пластину под небольшим углом и медленно добавляйте среду так, чтобы она постепенно соприкасалась с блоками matrix-DRG.
заметка: Если среда добавляется слишком быстро или энергично, матрица и/или DRG могут сместиться.
- Хранить анализы в инкубаторе при температуре 37 °C в течение следующих 48–72 ч.<бр/>
заметка: Периодическое изучение анализов покажет окружное вырастание нейритов по направлению к краю матрицы (Рисунок 2). Когда нейриты находятся на расстоянии более трех четвертей пути к матриксу, целесообразно пластинировать клетки.
3. Подготовка клеток рака головы и шеи
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом экспериментальном проекте можно использовать клеточные линии, отличные от клеток плоскоклеточного рака головы и шеи.
- Поддерживайте клеточные линии плоскоклеточного рака в DMEM с 10% FBS в предпочтительных колбах или чашках для культивирования в инкубаторе при температуре 37 °C. Чтобы подготовить клетки к экспериментам, отсосите всю среду из колбы или посуды для культуры и дважды промойте ее PBS. Приостановите клетки, добавив соответствующее количество 0,025% трипсина на 5 минут, а затем DMEM с 10% FBS. Пипеткой нанесите 4 мл клеточной и питательной смеси в чашки для культур объемом 6 мл. <бр/>
заметка: Культуральный планшет объемом 6 мл обеспечивает более чем достаточное количество клеток, даже если их слияние составляет менее 50%.
- Подвергайте клеточные линии HNSCC воздействию различных условий за 24 ч до окрашивания и нанесения покрытия по анализу DRG. Повторите дозу после того, как клетки будут покрыты, чтобы поддерживать постоянную среду.
заметка: Добавляйте антитела, факторы роста, цитокины или другие молекулы в чашки для клеточных культур через 1–2 дня после вскрытия мышей и имплантации DRG в матрикс.
- Добавьте флуоресцентные красители для клеток за 1 час до нанесения покрытия на клетки (через 2–3 дня после забора DRG и имплантации в матрикс).
заметка: Используемые здесь красители свободно проходят через клеточную мембрану; Однако после реакции с внутриклеточными тиоловыми группами краситель остается внутри клетки и передается дочерним клеткам. Окрашивание значительно облегчает визуализацию в анализах. Эти временные пятна идеально подходят для этих анализов, потому что флуоресценция присутствует в течение 2–3 дней, что является временными рамками этих экспериментов. Это также позволяет использовать множество различных цветов и устраняет необходимость в создании флуоресцентных клеточных линий, трансфицированных белками.
- Приготовьте 10 мкМ раствора красителя, смешав 2 мкл 10 мМ красителей стоковых клеток с 2 мл бессывороточного DMEM для каждого состояния клеток. Нагрейте его до 37 °C перед добавлением в клетки.
- Удалите питательную среду из планшета объемом 6 мл, оставив адгезивные клетки HNSCC на планшете. Добавьте 2 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) и удалите 2 мл 10 мкМ DMEM, не содержащего окрашивания клеток/сыворотки, добавленного на каждую пластину.
- Верните культуральный планшет объемом 6 мл с окрашиванием клеток в инкубатор при температуре 37 °C на 40 минут.
- Через 40 минут отсасывайте среду. Добавьте 2 мл PBS и аспирируйте его. Добавьте по 1 мл 0,025% трипсина в каждую пластину и установите их в инкубатор при температуре 37 °C.
- Добавьте 2 мл DMEM с 10% FBS через 3–5 минут и перенесите взвешенные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Раскрутите клетки и ресуспендируйте их в 1 мл DMEM с 10% FBS.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток, а затем добавьте DMEM с 10% FBS, чтобы получить концентрацию в 300 000 клеток на мл.
4. Покрытие клеток рака головы и шеи
- Извлеките из инкубатора планшеты со стеклянным дном с анализами matrix-DRG.
заметка: Опять же, они уместны, когда нейриты находятся не менее чем на 75% пути к краю матрицы, что обычно происходит через 2–3 дня. Лучше всего это видно с помощью объектива не менее 10X.
- Аспирируйте среду внутри стеклянной нижней пластины. Полностью отсасывайте среду внутри стеклянной лунки без снятия матричных блоков DRG.
- Наберите 200 мкл из среды с концентрацией 300 000 клеток/мл с помощью пипетки объемом 200 мкл. Поместите по две капли клеток на каждый анализ матрицы DRG. Выполните этот шаг для каждой матричной капли, создав четыре повтора каждого условия ячейки на одной пластине.
заметка: Полусферическая форма матрицы позволяет клеткам располагаться в кольце по периферии анализа (рис. 3а, рис. 3б). Поиск пипетки с плавным спусковым крючком значительно упрощает размещение равномерных капель.
- Подтвердите сходное количество клеток и распределение различных клеточных состояний с помощью микроскопии 4X.
- Поместите пластины со стеклянным дном в инкубатор при температуре 37 °C примерно на 60 мин.
заметка: Несмотря на небольшой объем клеток и сред (~150 мкл), анализы не высыхают до тех пор, пока не пройдет несколько часов пребывания в инкубаторе.
- Через 60 минут аккуратно добавьте 4 мл DMEM с 10% FBS вдоль боковой стенки стеклянной нижней пластины.
заметка: Со временем клетки частично прилипают к дну пластины, и способ добавления среды не нарушает клетки. Различным типам ячеек может потребоваться больше или меньше времени, чтобы начать прилипать к пластине со стеклянным дном.
- Замените в это время любые экзогенные препараты или факторы роста для поддержания прежних уровней концентрации.
- Верните анализы в инкубатор при температуре 37 °C, за исключением случаев, когда они исследуются под микроскопом. Количественно оцените результаты этого анализа с помощью микроскопической визуализации. Вкратце, подсчитаем нити периневральной инвазии в пределах четырех квадрантов, используя 4-кратное микроскопическое изображение.
заметка: Микроскоп с 4-кратным объективом и флуоресцентными возможностями достаточен для фотодокументирования анализов. Размер анализов хорошо вписывается в поле 4-кратного объектива, которое достаточно детализировано, чтобы охватить отдельные области периневральной инвазии. Периневральная инвазия становится очевидной в течение 24 ч, но после 48 ч целостность анализов начинает ослабевать, поскольку опухолевые клетки делятся по периферии матрикса и инвазируют. За пределами 48 ч также наблюдается значительный отток фибробластов из DRG, что затрудняет визуализацию с помощью светлопольной микроскопии. Поэтому рекомендуется фотографировать результаты с помощью 4-кратной микроскопии не менее двух раз в течение этого окна (например, через 24 и 48 ч после осаждения опухолевых клеток). Имейте в виду, что это трехмерные анализы, и полностью визуализировать весь анализ сложно. Большая часть периневральной инвазии происходит в плоскости от нижней части пластины, где клетки встроены в матрицу немного выше нижней части пластины. Поскольку эта плоскость близка к горизонтальной, подавляющее большинство нейритов с опухолевыми клетками захватываются на одноуровневом изображении с 4-кратным увеличением.
