1. Выбор побочной популяции (SP) с помощью анализа оттока красителя Хёхста
- Окрашивание 50 миллионов клеток красителем Hoechst 33342
- Приготовьте две стерильные пробирки объемом 15 мл с коническим дном: одну пробирку с маркировкой «Hoechst», а другую с маркировкой «Hoechst and Verapamil». Приготовьте 10 мл 5 мл раствора верапамила гидрохлорида в стерильной воде. Приготовьте питательную среду (КМ) для стволовых клеток.
- Для приготовления КМ для ЦСК (CM-CSC) комбинируйте следующее: модифицированную среду Dulbecco Eagle (DMEM): F12 (1:3, v:v), 5% сыворотки плода телят (FCS), 0,04 мг/л гидрокортизона, 100 ЕД/мл пенициллина, 0,1 г/л стрептомицина и 20 мкг/л эпидермального фактора роста (EGFR).
- Под ламинарным проточным колпаком проводят трипсинизацию клеток. Удалите фильтрующий материал, промойте стерильным фосфатным буфером (PBS) и добавьте 1 мл трипсина-ЭДТА (0,5 г/л) в колбу площадью 75 см². Инкубировать 3 мин при 37 °C. Остановить реакцию, добавив питательную среду, используемую для родительской клеточной линии. Подсчитайте количество ячеек с помощью счетчика ячеек.
- Для приготовления КМ для родительской клеточной линии (КМ-) добавьте в ДМЭМ 10% ФКС, 0,4 мг/л гидрокортизона, 100 ЕД/мл пенициллина и 0,1 г/л стрептомицина.
- Полученную на стадии 1.1.2 клеточную суспензию разбавляют до получения 10–7 клеток/мл в CM-P. Разделите клеточную суспензию на две подготовленные пробирки: положите 100 мкл (106 клеток) в пробирку "Hoechst and Verapamil" и 4 мл (4 x 107 клеток) в пробирку "Hoechst".
- В образец «Хёхст и Верапамил» добавить 10 мкл 5 мМ раствора верапамила гидрохлорида (конечная концентрация: 0,5 мМ) и аккуратно перемешать. Добавьте 5 мкл 1 г/л раствора Hoechst (конечная концентрация: 0,1 г/л). В образец "Hoechst" добавьте 5 μL 1 г/л раствора Hoechst на 106 клеток (всего 200 μл). В дальнейшем образцы должны быть защищены от прямого воздействия света с помощью алюминиевой фольги.
- Инкубируйте все пробирки на водяной бане при температуре 37 °C в течение 1 часа 30 минут. Осторожно перемешивайте каждые 15 минут, чтобы предотвратить оседание клеток.
- Центрифужные пробирки при 250 x g в течение 5 минут при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждую гранулу 2 мл 1x PBS.
- Центрифужируйте пробирки при температуре 250 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулу "Hoechst and Verapamil" в 500 мкл 5 мг/л йодида пропидия (PI), разведенного в буфере PBS, и гранулу "Hoechst" в 4 мл 5 мг/л PI, разведенной в буфере PBS.
- Переносите растворы проб через сетчатый фильтр для клеток размером 70 мкм для удаления агрегатов и сбора отдельных клеток в пробирки для забора образцов на проточном цитометре. Держите образцы на льду и защищайте от прямого воздействия света с помощью алюминиевой фольги.
2. Выделение популяции сторон, исключая краситель Хёхста, методом сортировки клеток
- Разделение отрицательных клеток по методу Хёхста проводят на сортировщике проточной цитометрии со следующими параметрами: УФ-лазер (355 нм), два детектора на тракте УФ-лазера с синими фильтрами Хёхста (450/50 БП) и красными фильтрами Хёхста (610/20 б.н.), а также два коллектора.
- Сначала проанализируйте образец «Hoechst», который служит положительным контролем для окрашивания и настройки проточного цитометра.
- Используя программное обеспечение цитометра, в окне «Глобальный рабочий лист» нажмите на «Точечный график» (пятый верхний правый рисунок) и создайте диаграмму на глобальном рабочем листе. На ординате щелчком правой кнопкой мыши выберите FSC-A (прямое рассеивание), а на абсциссе SSC-A (боковое рассеивание) (рис. 1A). Таким же образом создайте точечную диаграмму SSC-W против SCC-H. На этой второй точечной диаграмме, чтобы создать область P1, нажмите "Polygon gate" (четырнадцатый верхний правый рисунок) (Рисунок 1B).
заметка: Область P1 будет включать в себя одиночные ячейки и дискриминирующие дублеты.
- Необязательно: Исключите PI-положительные клетки, создав FSC-A в сравнении с PI, забитым на P1. На этой точечной диаграмме выберите PI-отрицательную популяцию (P2), чтобы исключить PI-положительные мертвые клетки.
- Используя программное обеспечение для цитометра, в окне «Глобальный рабочий лист» нажмите на «Точечный график» и создайте диаграмму на глобальном рабочем листе. На ординате щелчком правой кнопкой мыши выберите синий Hoechst-A, а на абсциссе красный Hoechst-A. Щелкнув правой кнопкой мыши по населению, выберите «Показать население» и P1. На этой точечной диаграмме создайте область (P2) для выбора отрицательных клеток популяции красителя Хёхста (SP), которые отображаются в виде бокового рукава слева от основной популяции клеток (рис. 1C).
- Проанализируйте выборку "Hoechst" и соберите 10 000 событий. Чтобы убедиться, что вентиль P2, представляющий популяцию SP, расположен правильно, проанализируйте выборку «Хёхст и Верапамил» (10 000 событий) для наблюдения за исчезновением популяции SP (рисунок 1D).
- Соберите отрицательные красители SP Hoechst в пробирку объемом 15 мл, содержащую 1 мл CM-CSC, приготовленного на шаге 1.1.1.
- По окончании сортировки клеток центрифугировать клеточную суспензию при 250 х г в течение 5 мин, удалить надосадочную жидкость и повторно суспендировать гранулу 1 мл CM-CSC. Подсчитайте количество отсортированных клеток с помощью счетчика клеток и перенесите соответствующее количество клеток в колбу для культур (см. таблицу 1). Добавьте CM-CSC и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2 атмосферы.
- Поддерживайте клетки в культуре в одних и тех же условиях в течение максимум двух пассажей до тех пор, пока не останется минимум 5 x 10-7 клеток.
Таблица 1: Тип колбы для культур для использования в зависимости от количества сортируемых ячеек. Приведены подробные сведения о размере колбы для культуры для приблизительного количества отсортированных клеток. Также приведены объем трипсина и объем среды, необходимый для типа колбы для культур.
| Количество отсортированных ячеек | Тип колбы для культуры | Объем трипсина (мл) | Средний объем культуры (мл) |
| 10 000-200 000 | 1 лунка из 6-луночной тарелки или чашки Петри 3,5 см | 0,5 | 2 |
| 200 000-1 000 000 | 1 колба для культур T25 | 1 | 4 |
| > 1 000 000 | 1 колба для культур T75 | 2 | 10 |
