1. Анализ MTT на лейкозные клетки
- Заранее приготовьте раствор МТТ: растворите 500 мг формазана МТТ в 10 мл PBS и перемешайте (в защищенном от света месте) магнитной мешалкой в течение примерно 1 ч. Стерилизуйте раствор с помощью фильтра 0,22 мкм.
заметка: Раствор можно хранить в аликвотах объемом 10 мл при температуре −20 °C. После размораживания беречь от попадания прямых солнечных лучей.
- Заранее приготовьте подкисленный изопропанол: добавьте 50 мл 2 М HCl к 2,5 л изопропанола.
заметка: Перед применением раствор хранят не менее одного месяца при комнатной температуре. Если изопропанол не подкисляется должным образом, он может образовывать осадки в среде и нарушать спектрофотометрические показания.
- Подготовьте отдельную 96-луночную пластину с плоским дном «День 0» (контрольный) для обеспечения более точной оценки ингибирования роста: Выделите от 3 до 6 лунок на клеточную линию, добавьте 30 мкл питательной среды и 120 мкл клеточной суспензии (8 000 клеток) на каждую лунку и 150 мкл питательной среды в лунки, соответствующие заготовкам (без клеток). Перейдите с шага 1.9 по шаг 1.13 данного раздела для измерения оптической плотности (OD).
- Подготовьте 96-луночный экспериментальный планшет с плоским дном: Выделите 30 лунок для концентраций препарата (10 концентраций, каждая в трех экземплярах), 10 лунок для контроля клеток и 10 лунок для контроля среды без клеток (заготовок) и приготовьте диапазон разведения препарата дексаметазона (Dex) с использованием диметилсульфоксида в качестве растворителя.
заметка: Для ячеек CEM-WT диапазон разведения Dex составляет от 2 мкМ до 0,97 нМ. Для ячеек CEM/R30dm, CEM-R5 и CEM-C3 диапазон разведения Dex составляет от 640 мкМ до 0,33 нМ.
- Добавьте 30 мкл из каждого разведения Dex в соответствующую лунку 96-луночного планшета. Убедитесь, что каждая концентрация указана в трех экземплярах.
- Добавьте 30 мкл питательной среды в лунки, соответствующие контрольным ячейкам, и 150 мкл питательной среды в лунки, соответствующие заготовкам.
- Собирайте экспоненциально растущие клетки и ресуспендируйте при их оптимальной концентрации при посеве.
заметка: Для того чтобы определить оптимальные концентрации исходных клеток, рекомендуется оценить профиль роста каждой клеточной линии в 96-луночном планшете путем засеивания клеток в нескольких концентрациях и его ежедневного измерения в течение не менее 4 дней. Выбирайте концентрацию посева, предотвращающую чрезмерный рост клеток через 72 ч, так как это повлияет на эксперимент за счет насыщения значений OD. Для CEM-WT, CEM-C5 и CEM-R5 оптимальная концентрация посева составляет 8 000 клеток/лунку, в то время как для CEM/R30dm она составляет 5 000 клеток/лунку.
- Добавьте 120 мкл клеточной суспензии в каждую лунку, содержащую либо раствор лекарственного средства, либо питательную среду (лунки, соответствующие контрольным клеткам). Заполните пустые внешние лунки планшета 150 μL PBS для обеспечения хорошей влажности в планшете и инкубируйте планшеты в течение 72 часов при 37 °C с 5% CO₂ в инкубаторе для клеточных культур.
- Добавьте 15 μL раствора MTT в каждую лунку и встряхивайте планшет в течение 5 минут с помощью вибростенда до максимальной скорости 900 встряхиваний/мин.
- Поместите планшеты обратно при температуре 37 °C с 5% CO₂ в инкубатор для клеточных культур и инкубируйте еще 4–6 часов.
- Добавьте 150 мкл подкисленного изопропанола в каждую лунку и хорошо перемешайте многоканальной пипеткой, чтобы полностью суспендировать все кристаллы формазана. Начните с глухих лунок и обязательно хорошо промойте кончики, прежде чем переходить к следующему ряду тарелки.
- Инкубируйте планшет при комнатной температуре (RT) в течение 10 минут.
- С помощью считывателя микропланшетов определите внешний диаметр на длинах волн 540 и 720 нм, чтобы обеспечить точное измерение с поправкой на фоновый внешний диаметр. Затем сохраните данные в файле электронной таблицы и проанализируйте их.
2. Анализ данных для анализа MTT
- Рассчитаем значения наружного диаметра ячеек в "День 0" по следующей формуле:
ODДень 0 =Контрольные ячейки OD - Средний ODхолостых лунок
- Рассчитайте процент выживших клеток для каждой концентрации препарата по следующей формуле:
% обработанных клеток = Среднее значение [Обработанные OD клетки - Среднее количествооткрытых лунок - ODдень 0]/[Контрольные ячейки OD - Среднее количествооткрытых лунок -OD день0]*100
- Построение кривой доза-реакция (зависимость концентрации препарата от ингибирования роста в %).
- Рассчитайте концентрацию препарата, подавляющего рост клеток на 50% (IC50), с помощью кривой «доза-ответ».
